En guide til å generere og bruke hiPSC Avledet NPCer for studier av nevrologiske sykdommer
Summary
This protocol describes how neural progenitor cells can be differentiated from human induced pluripotent stem cells, in order to yield a robust and replicative neural cell population, which may be used to identify the developmental pathways contributing to disease pathogenesis in many neurological disorders.
Abstract
Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long period of disease progression prior to the onset of symptoms. Because fibroblasts from patients and healthy controls can be efficiently reprogrammed into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), and subsequently differentiated into neural progenitor cells (NPCs) and neurons for the study of these diseases, it is now possible to recapitulate the developmental events that occurred prior to symptom onset in patients. We present a method by which to efficiently differentiate hiPSCs into NPCs, which in addition to being capable of further differentiation into functional neurons, can also be robustly passaged, freeze-thawed or transitioned to grow as neurospheres, enabling rapid genetic screening to identify the molecular factors that impact cellular phenotypes including replication, migration, oxidative stress and/or apoptosis. Patient derived hiPSC NPCs are a unique platform, ideally suited for the empirical testing of the cellular or molecular consequences of manipulating gene expression.
Introduction
Genuttrykkstudier av nevroner differensiert in vitro fra menneskeskapte pluripotente stamceller (hiPSCs) med oss en og andre 2,3 indikerer at hiPSC nevroner ligne foster snarere enn voksen hjernevev. I dag kan hiPSC-baserte modeller være mer hensiktsmessig for studiet av predisposisjon for, heller enn sent trekk, nevrologisk sykdom. Vi har tidligere rapportert at en betydelig fraksjon av genet signatur av schizofreni hiPSC-avledede neuroner er konservert i schizofreni hiPSC-avledet nevrale stamceller (NPC), noe som indikerer at NPC kan være et nyttig celletype for å studere de molekylære reaksjonsveier som bidrar til schizofreni 1 . Vi og andre har rapportert avvik migrasjon, økt oksidativt stress og reaktive oksygenforbindelser, følsomhet for sub-terskel miljømessige påkjenninger og nedsatt mitokondriefunksjon ved schizofreni hiPSC NPC 1,4-6, samt redusert neuronal ctilkoblingsmuligheter og synaptisk funksjon i schizofreni hiPSC nevroner 5,7-10. Hvis de molekylære faktorer som bidrar til avvikende migrasjon og / eller oksidativt stress i schizofreni hiPSC NPCer også ligger til grunn for redusert nevronale tilkobling i schizofreni hiPSC-avledet nevroner, kan NPCer være en robust og svært replicative nevrale befolkning med å studere mekanismene som er ansvarlige for sykdom. Videre, fordi man hurtig kan generere et stort antall celler, og behøver ikke å vente i flere uker eller måneder for neuronal modning, NPC-baserte analyser er egnet for studier av Større materialer og er mer mottakelig for high throughput screening. Vi tror at hiPSC NPCer kan tjene som en proxy for de utviklingsveier potensielt bidrar til sykdom patogenesen, som allerede har blitt demonstrert i lidelser så forskjellige som schizofreni 1 og Huntingtons sykdom 11.
For å skille NPCer fra hiPSCs, innledende nevrale iproduksjonen skjer ved dual-SMAD hemming (0,1 mM LDN193189 og 10mm SB431542) 12. Ved å antagonisere BMP og TGF signalering med disse små molekyler, er endoderm og mesoderm spesifikasjon blokkert, akselererende neuronal differensiering og fører til dannelsen av synlige nevrale rosetter innen en uke etter plating. Neural mønster opptrer tidlig i prosessen, antagelig i løpet av neural rosett-dannelse og umiddelbart etterpå. I mangel av andre signaler, disse primitive nervecellene anta en anterior forhjerne-lignende skjebne 13. Umiddelbart etter nevrale rosett formasjon, og fortløpende gjennom NPC ekspansjon, forhjerne NPCer dyrkes med FGF2 8,14. De har dobbelt avstamning potensial og kan differensieres til nevrale populasjoner av 70-80% III-tubulin-positive nevroner og 20-30% glial fibrillære surt protein (GFAP) -positive astrocytter (figur 1). Flertallet av forhjerne hiPSC nevroner er VGLUT1-positive, Og så er antagelig glutamaterg, selv om ca 30% av nevronene er GAD67-positive (GABAergic) 8.
NPC blir rutinemessig passert mer enn ti ganger in vitro, og samtidig opprettholde konsistente differensierings profiler, og uten å akkumulere Karyotype abnormaliteter. Grupper har rapportert aging NPCer mer enn 40 ganger 15, derimot, finner vi at utover ti passasjer, viser NPCer økt tilbøyelighet for astrocyte differensiering. NPCer godt tolerere flere fryse-tiner og kan overført til å vokse som neurosfærer ved ganske enkelt å dyrke i ikke-heftende plater. NPCer er effektivt omformet av virale vektorer, muliggjør rask evaluering av de molekylære og cellulære konsekvensene av genetisk forstyrrelse, og lett utvides for å gi tilstrekkelig materiale for biokjemiske studier. Videre, fordi virale vektorer tillater robuste over-ekspresjon og / eller knockdown av sykdomsrelevant gener, enten kontroll eller pasient avledet Neural-celler, kan man bruke denne plattform for å teste effekten av genetisk bakgrunn på disse manipulasjoner. Selv om ikke egnet for synaptic eller aktivitetsbaserte analyser som krever modne nevroner, kan NPCer være et praktisk alternativ for mange enkle molekylære eller biokjemiske analyser av pasient avledet nevrale celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har beskrevet metoder ved å skille hiPSCs inn NPCer, en nervecelletype der en betydelig andel av genet signaturen til hiPSC-avledet nevroner er bevart og som kan fungere som en proxy for de utviklingsveier potensielt bidrar til sykdom patogenesen 8, 11. I tillegg, som vi har beskrevet, NPCer er en robust replicative og enkelt transdusert nevrale befolkning, som vi mener kan være egnet for biokjemiske og molekylærbiologiske studier av sykdom predisposisjon.
Selv om vi har det…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kristen Brennand is a New York Stem Cell Foundation – Robertson Investigator. The Brennand Laboratory is supported by a Brain and Behavior Young Investigator Grant, National Institute of Health (NIH) grant R01 MH101454 and the New York Stem Cell Foundation.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Life Technologies | #11330 | for HES media |
| DMEM/F12 | Life Technologies | #10565 | for neural media |
| KO-Serum Replacement | Life Technologies | #10828 | Needs to be lot tested |
| Glutamax | Life Technologies | #35050 | |
| NEAA | Life Technologies | #11140 | |
| 2‐mercaptoethanol (55mM 1000x) | Life Technologies | #21985-023 | |
| N2 | Life Technologies | #17502-048 | Needs to be lot tested |
| B27-RA | Life Technologies | #12587-010 | Needs to be lot tested |
| FGF2 | Life Technologies | #13256-029 | Resuspend in PBS + 1% BSA |
| LDN193189 | Stemgent | #04-0074 | |
| SB431542 | Stemgent | #04-0010 | |
| BDNF | Peprotech | #450-02 | Resuspend in PBS + 0.1% BSA |
| GDNF | Peprotech | #450-10 | Resuspend in PBS + 0.1% BSA |
| Dibutyryl cyclic-AMP | Sigma | #D0627 | Resuspend in PBS + 0.1% BSA |
| L-ascorbic acid | Sigma | #A0278 | Resuspend in H20 |
| STEMdiff Neural Rosette Selection Reagent | Stemcell Technologies | #05832 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | |
| Collagenase IV | Life Technologies | #17104019 | |
| CF1 mEFs | Millipore | #PMEF-CF | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | |
| Laminin, Natural Mouse 1mg | Life Technologies | #23017-015 | |
| BD Matrigel | BD | #354230 | Resuspend on ice in cold DMEM at 10mg/ml, use 1mg per two 6-well plate equivalent |
| Tissue culture treated 6-well plates | Corning | 3506 | |
| Ultra low attachment 6-well plates | Corning | 3471 | |
| goat anti-Sox2 | Santa Cruz | sc17320 | use at 1:200 |
| mouse anti-human Nestin | Millipore | MAB5326 | use at 1:200 |
| rabbit anti-βIII-tubulin | Covance | PRB435P | use at 1:500 |
| mouse anti-βIII-tubulin | Covance | MMS435P | use at 1:500 |
| mouse anti-MAP2AB | Sigma | M1406 | use at 1:200 |
| Plate centrifuge | Beckman Coulter | Beckman Coulter Allegra X-14 (with SX4750 plate carrier) |
Riferimenti
- Brennand, K., et al. Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia. Mol Psychiatry. , (2014).
- Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development. Cell Stem Cell. 12, 573-586 (2013).
- Mariani, J., et al. Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 12770-12775 (2012).
- Hashimoto-Torii, K., et al. Roles of heat shock factor 1 in neuronal response to fetal environmental risks and its relevance to brain disorders. Neuron. 82, 560-572 (2014).
- Robicsek, O., et al. Abnormal neuronal differentiation and mitochondrial dysfunction in hair follicle-derived induced pluripotent stem cells of schizophrenia patients. Mol Psychiatry. 18 (10), 1067-1076 (2013).
- Paulsen, B. D., et al. Altered oxygen metabolism associated to neurogenesis of induced pluripotent stem cells derived from a schizophrenic patient. Cell Transplant. 21 (7), 1547-1559 (2012).
- Yu, D. X., et al. Modeling hippocampal neurogenesis using human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2, 295-310 (2014).
- Brennand, K. J., et al. Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells. Nature. 473 (7346), 221-225 (2011).
- Wen, Z., et al. Synaptic dysregulation in a human iPS cell model of mental disorders. Nature. , (2014).
- Zhang, L., Song, X., Mohri, Y., Qiao, L. Role pf Inflammation and Tumor Microenvironment in the Development of Gastrointestinal Cancers: What Induced Pluripotent Stem Cells Can Do. Current stem cell research & therapy. , (2014).
- An, M. C., et al. Genetic Correction of Huntington’s Disease Phenotypes in Induced Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 11 (2), 253-263 (2012).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
- Pankratz, M. T., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
- Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143, 527-539 (2010).
- Sareen, D., et al. Chromosome 7 and 19 trisomy in cultured human neural progenitor cells. PLoS One. 4, e7630 (2009).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Cowan, C. A., et al. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N Engl J Med. 350, 1353-1356 (2004).
- Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24, 185-187 (2006).
- Coufal, N. G., et al. L1 retrotransposition in human neural progenitor cells. Nature. 460, 1127-1131 (2009).
- Xia, G., et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells to model spinocerebellar ataxia type 2 in vitro. Journal of molecular neuroscience : MN. 51, 237-248 (2013).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).
- Delaloy, C., et al. MicroRNA-9 coordinates proliferation and migration of human embryonic stem cell-derived neural progenitors. Cell Stem Cell. 6, 323-335 (2010).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson’s disease. Nature. 480, 547-551 (2011).
- Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 559-572 (2013).
- Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nat Neurosci. 15, 477-486 (2012).
- Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77, 440-456 (2013).
