형질, 선택 및 인간 유도 만능 줄기 세포의 콜로니 따기는 AAVS1 세이프 하버 (Safe Harbor)에 GFP 유전자 TALEN는 타겟팅
Summary
TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.
Abstract
Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral vector mediated random integration. This protocol describes a universal and efficient transgene targeted addition platform in human iPSCs based on utilization of validated open-source TALENs and a gene-trap-like donor to deliver transgenes into a safe harbor locus. Importantly, effective gene editing is rate-limited by the delivery efficiency of gene editing vectors. Therefore, this protocol first focuses on preparation of iPSCs for transfection to achieve high nuclear delivery efficiency. When iPSCs are dissociated into single cells using a gentle-cell dissociation reagent and transfected using an optimized program, >50% cells can be induced to take up the large gene editing vectors. Because the AAVS1 locus is located in the intron of an active gene (PPP1R12C), a splicing acceptor (SA)-linked puromycin resistant gene (PAC) was used to select targeted iPSCs while excluding random integration-only and untransfected cells. This strategy greatly increases the chance of obtaining targeted clones, and can be used in other active gene targeting experiments as well. Two weeks after puromycin selection at the dose adjusted for the specific iPSC line, clones are ready to be picked by manual dissection of large, isolated colonies into smaller pieces that are transferred to fresh medium in a smaller well for further expansion and genetic and functional screening. One can follow this protocol to readily obtain multiple GFP reporter iPSC lines that are useful for in vivo and in vitro imaging and cell isolation.
Introduction
배아 줄기 세포와 유사한 유도 만능 줄기 세포로 (iPSCs)를 인간의 체세포를 재 프로그램 할 수있는 기능이 처음 다카하시 등에 의해 발견되었다. 2007 1. 레트로 바이러스는 네 개의 전사 인자를 발현하는 형질 도입 인간 피부 섬유 아세포 (소위 불리는 야마나카는 OCT3 요인 / 4, SOX2, C-Myc와, 그리고 Klf4)는 형태, 증식, 유전자 발현 및 후생 유전 학적 상태에 따라 인간 배아 줄기 세포 (인간 배아 줄기)에 매우 유사한 것으로 나타났다; 결정적 iPSCs 또한 모든 세 배엽 (1)의 세포로 분화 할 수있다. iPSCs의 증식 잠재력과 차별화 용량은 그들에게 매우 매력적인 도구를 만드는; 특정 질병을 앓고있는 환자로부터 세포를 재 프로그래밍함으로써 iPSCs 체외 질병 모델 시스템과 같은 잠재적 치료제로서 모두 사용될 수있다.
후자의 목적을 위해, 몇 가지 문제 iPSCs의 잠재력하기 전에 해결해야임상 환경에서 실현 될 수있다; 시험 관내 배양 된 인간 배아 줄기 및 iPSCs, 리 프로그래밍 및 세포 유지하는 동안 이종 유도체의 사용의 발암 가능성, 및 생체 내에서 이식 된 세포를 추적 할 필요성은 Hentze 외 의해 검토 다 능성 줄기 세포의 임상 적용 (모든 중요한 장애물이다. 2). 분화 된 세포를 이식 후 추적의 필요성에 이상적인 솔루션에 관계없이 응용 프로그램의 침묵과 잡색 레지스트 시각적으로 검출 마커를 포함한다. 외래 DNA가 안전한 항구 궤적에 도입 될 때 통합 된 유전자의 강력하고 지속적인 표현은 가장 쉽게 달성 할 수있다; 즉, 통합 벡터의 충분한 전사를 활성화 이웃 게놈 부위에서 유전자 발현의 3 교란을 완화하는 동시에. 아주 잘 그것의 발견 이후 특징으로 한 그러한 사이트는 아데노 관련 바이러스 integr입니다단백질 인산 가수 분해 효소 (1) 규제 서브 유닛 12C (PPP1R12C) 유전자의 첫 번째 인트론에 ATION 사이트 1 (AAVS1). 이 궤적 유지 및 연장 시간을 통해 통합 된 유전자의 강력한 표현 문화의 체외 분화 3뿐만 아니라, 전사 섭 4에서 유전자를 둘러싼 보호하기 위해 허용 할뿐만 아니라 보였다; 두 기능으로 인해 AAVS1 사이트 (5)의 측면에 내인성 염색질 절연체 요소의 존재에 의한 것으로 생각된다.
방금 지난 10 년간 게놈 엔지니어링 툴의 발전은 크게 임의의 세포 유형의 유전 조작이 달성 될 수있는 용이성 및 효율성을 촉진 하였다. 초기의 성공적인 실험는 ESC -6,7- 타겟팅 유전자를 달성하기 위해 도입 된 도너 내인성 상동 재조합 (HR)의 상당히 낮은 수준에 의존하지만, 예컨대 징크 핑거 뉴 클레아 제 (ZFNs), 유의 사항과 부위 – 특이 적 뉴 클레아 제의 사용ficantly 같은 실험 8,9의 효율성을 크게 증가 이중 가닥 DNA 휴식의 생성을 통해 상동 재조합을 유도한다. 모두 전사 활성제와 같은 이펙터 식물 병원성 크 산토 모나스 장군의 (이야기)와 원핵 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 회문 반복 (CRISPR) 효율적인 사이트 별 디자이너 클레아 제에 / Cas9 시스템의 용도 변경은 만능 줄기 세포에서 표적 유전자를했다 접근 실행 가능한 방법론 10-13.
최근의 논문은 이야기 클레아 제 (TALENs) (14)를 사용하여 인간 iPSCs의 AAVS1 안전 항구의 궤적에 녹색 형광 기자 카세트의 안정적 통합을위한 효율적인 방법을 설명했다. 이러한 목표 iPSCs는의 유용성에 대한 강력한 증거를 제공, 심지어 심근 경색 (MI)의 마우스 모델로 심근 세포 이식에 관한 분화 후 자신의 형광을 유지안정적으로 형광 만능 줄기 세포 (14). 타겟팅 콜로니를 수득하기 위해, 유전자 트랩 방법 플라이 싱 – 억 셉터 (SA)는, 2A 자체 절단 단백질 서열은 내인성 PPP1R12C 프로모터의 제어 하에서 퓨로 마이신 N- 아세틸 전이 효소 (PAC) 유전자를 배치 상기 사용 하였다; 따라서, AAVS1 유전자좌 DNA 공여체를 도입 한 경우에만 iPSCs는 퓨로 마이신 내성에 기초하여 선택 가능하게 이들을 렌더링 PAC 표현; (그림 1, 15). 이 프로토콜에 기반 iPSCs를 AAVS1-GFP iPSCs가 TALENs와 iPSCs를 형질 감염의 과정과 AAVS1 안전 항구의 궤적에 4.2kb DNA 단편을 통합 할 수있는 9.8 킬로바이트 기증자를 포함, 최근 종이 (14)에보고 생성 선택하는 절차의 자세한 사항 퓨로 마이신 저항 및 클론 확장을위한 따기 식민지. 본원에 설명 된 기술들은 많은 유전체 공학 실험에 적용 할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
(1) 효율적으로 형질 전환에 의해 iPSCs에 TALEN 및 기증자 플라스미드를 전달; AAVS1 안전 항구의 성공적인 세대를위한 가장 중요한 단계는 인간의 iPSCs가되는 대상 (2) 형질 전환 후 형질 전환 및 도금 밀도 전에 단일 세포로 iPSCs의 분리를 최적화; (3) 투여 량 및 IPSC 라인의 성장에 기초한 약물 – 선택 시간을 최적화; (4)주의 깊게 해부 및 대상 식민지를 따기와 / 웰 새 접시에 전송. Hockemeyer의 용지 (10…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the NIH Common Fund and Intramural Research Program of the National Institute of Arthritis, Musculoskeletal, and Skin Diseases.
Materials
| NAME OF MATERIAL/EQUIPMENT | COMPANY | CATALOG # | COMMENTS/DESCRIPTION |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-Free, 10mL | Corning | 354230 | Store at -20°C. |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320-033 | Store at 4°C. |
| Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates | Corning | 3506 | |
| Essential 8 Medium | Life Technologies | A1517001 | Store basal medium at 4°C. Store supplement at -20°C. |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | Store at room temp. Once dissolved in H2O, store at -20°C. |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886-500G | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575-020 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-250 | |
| 100mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430167 | |
| DR4 MEF 2M IRR – Academic | GlobalStem | GSC-6204G | Store in liquid Nitrogen. |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995-040 | Store at 4°C. |
| Defined Fetal Bovine Serum, US Origin | HyClone | SH30070.03 | Store at -20°C. Thaw at 4°C overnight and aliquot. Store aliquots at -20°C until needed. |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140-050 | Store at 4°C. |
| 4D-Nucleofector Core unit | Lonza | AAF-1001B | part of the electroporation system |
| 4D-Nucleofector X unit | Lonza | AAF-1001X | part of the electroporation system |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT) | Lonza | V4XP-3024 | Upon arrival, remove Primary Cell Solution and supplement and store at 4°C. |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A1110501 | Store at -20°C. Thaw overnight at 4°C and warm an aliquot in a 37°C water bath before use. |
| NutriStem XF/FF Culture Medium | Stemgent | 01-0005 | Store at -20°C. Thaw overnight at 4°C |
| AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 and pZT-AAVS1-R1) | Addgene | 52637 and 52638 | |
| AAVS1-CAG-EGFP Homologous Recombination donor | Addgene | 22212 | |
| Puromycin Dihydrochloride | Life Technologies | A11138-03 | Store at -20°C. Prepare working aliquots of 1 mg/mL in ddH2O. |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Sorvall Legend XTR (Refrigerated), 120V 60Hz | Thermo Scientific | 75-004-521 | |
| TX-750 4 × 750mL Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientific | 75003607 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 |
Riferimenti
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Hentze, H., Graichen, R., Colman, A. Cell therapy and the safety of embryonic stem cell-derived grafts. Trends Biotechnol. 25 (1), 24-32 (2007).
- Smith, J. R., et al. Robust, persistent transgene expression in human embryonic stem cells is achieved with AAVS1-targeted integration. Stem Cells. 26 (2), 496-504 (2008).
- Lombardo, A., et al. Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer. Nat Methods. 8 (10), 861-869 (2011).
- Ogata, T., Kozuka, T., Kanda, T. Identification of an insulator in AAVS1, a preferred region for integration of adeno-associated virus DNA. J Virol. 77 (16), 9000-9007 (2003).
- Zwaka, T. P., Thomson, J. A. Homologous recombination in human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 21 (3), 319-321 (2003).
- Urbach, A., Schuldiner, M., Benvenisty, N. Modeling for Lesch-Nyhan disease by gene targeting in human embryonic stem cells. Stem Cells. 22 (4), 635-641 (2004).
- Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases. Nature biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).
- Zou, J., et al. Gene targeting of a disease-related gene in human induced pluripotent stem and embryonic stem cells. Cell stem cell. 5 (1), 97-110 (2009).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature. 29 (8), 731-734 (2011).
- Sanjana, N. E., et al. A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering. Nature protocols. 7 (1), 171-192 (2012).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell stem cell. 12 (4), 393-394 (2013).
- Luo, Y., et al. Stable Enhanced Green Fluorescent Protein Expression After Differentiation and Transplantation of Reporter Human. Induced Pluripotent Stem Cells Generated by AAVS1 Transcription Activator-Like Effector Nucleases. Stem Cells Transl Med. 3 (7), 821-835 (2014).
- Zou, J., et al. Oxidase-deficient neutrophils from X-linked chronic granulomatous disease iPS cells: functional correction by zinc finger nuclease-mediated safe harbor targeting. Blood. 117 (21), 5561-5572 (2011).
- Luo, Y., Rao, M., Zou, J. Generation of GFP Reporter Human Induced Pluripotent Stem Cells Using AAVS1 Safe Harbor Transcription Activator-Like Effector Nuclease. Curr Protoc Stem Cell Biol. 29, 5A.7.1-5A.7.18 (2014).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7, 2029-2040 (2012).
