Transfection, seleção e Colony-picking de induzidas pelo homem pluripotentes Células-Tronco TALEN-alvo com um gene GFP no AAVS1 Safe Harbor

Summary

TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.

Abstract

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral vector mediated random integration. This protocol describes a universal and efficient transgene targeted addition platform in human iPSCs based on utilization of validated open-source TALENs and a gene-trap-like donor to deliver transgenes into a safe harbor locus. Importantly, effective gene editing is rate-limited by the delivery efficiency of gene editing vectors. Therefore, this protocol first focuses on preparation of iPSCs for transfection to achieve high nuclear delivery efficiency. When iPSCs are dissociated into single cells using a gentle-cell dissociation reagent and transfected using an optimized program, >50% cells can be induced to take up the large gene editing vectors. Because the AAVS1 locus is located in the intron of an active gene (PPP1R12C), a splicing acceptor (SA)-linked puromycin resistant gene (PAC) was used to select targeted iPSCs while excluding random integration-only and untransfected cells. This strategy greatly increases the chance of obtaining targeted clones, and can be used in other active gene targeting experiments as well. Two weeks after puromycin selection at the dose adjusted for the specific iPSC line, clones are ready to be picked by manual dissection of large, isolated colonies into smaller pieces that are transferred to fresh medium in a smaller well for further expansion and genetic and functional screening. One can follow this protocol to readily obtain multiple GFP reporter iPSC lines that are useful for in vivo and in vitro imaging and cell isolation.

Introduction

A capacidade de reprogramar células somáticas humanas em células-tronco pluripotentes induzidas semelhantes a células-tronco embrionárias (iPSCs) foi descoberto pela primeira vez por Takahashi et al., Em 2007 ^1. Fibroblastos dérmicos humanos transduzidas com retrovírus expressando quatro fatores de transcrição (The Yamanaka assim apelidado fatores OCT3 / 4, Sox2, foram mostradas c-Myc, e KLF4) ser altamente semelhante às células estaminais embrionárias humanas (hESCs) com base na morfologia, a proliferação, a expressão do gene, e estado epigenética; crucialmente, iPSCs também são capazes de se diferenciarem em células de todas as três camadas germinais ^1. A capacidade potencial e diferenciação proliferativa das iPSCs torna ferramentas muito atraentes; reprogramando as células de pacientes que sofrem de doenças específicas, iPSCs pode ser utilizado tanto como em sistemas modelo in vitro da doença e como potenciais agentes terapêuticos.

Para este último efeito, várias questões devem ser abordadas antes de todo o potencial das iPSCsem um ambiente clínico pode ser realizado; o potencial tumorigénico de hESCs cultivadas in vitro e iPSCs, o uso de derivados de xenogénicas durante reprogramação e manutenção de células, e a necessidade de rastrear células transplantadas in vivo de todos os obstáculos cruciais para a aplicação clínica de células estaminais pluripotentes (Avaliado por Hentze et al. ^2). Uma solução ideal para a necessidade de rastrear células diferenciadas pós-transplante envolveria um marcador visualmente detectável que resiste ao silenciamento e variegação, independentemente da aplicação. Expressão robusta e sustentada de transgenes integrados é o mais prontamente possível quando DNA exógeno é introduzido no porto seguro loci; isto é, locais genómicos que permitem a transcrição de um vector suficiente integrado, enquanto ao mesmo tempo atenuar as perturbações de expressão de genes vizinhos ^3. Um tal local que tem sido muito bem caracterizada, desde a sua descoberta, é a integr vírus adeno-associadoção local 1 (AAVS1), no primeiro intrão 1 do regulador 12C subunidade (PPP1R12C) do gene da proteína fosfatase. Este local foi mostrado não só para permitir sustentada e expressão robusta de transgenes integrados através do tempo estendido na cultura e na diferenciação vitro ^3, mas também para proteger circundante genes de perturbação da transcrição ^4; ambas as características são provavelmente devido à presença de elementos isoladores de cromatina endógenas que flanqueiam o local AAVS1 ^5.

Os avanços na engenharia ferramentas genoma durante apenas a última década, têm muito facilitada a facilidade e eficiência com que as manipulações genéticas em qualquer tipo de célula pode ser conseguido. Embora experiências bem sucedidas iniciais invocado extremamente baixos níveis de recombinação homóloga endógena (RH) com um doador introduzidas para se abordagem selectiva de genes em ^6,7 CES, o uso de nucleases específicas do local, tais como as nucleases de dedos de zinco (ZFNs), que signivamente induzir a recombinação homóloga através da geração de uma quebra de cadeia dupla de DNA tem aumentado consideravelmente a eficiência de tais experiências ^8,9. O reaproveitamento de ambos os ativadores de transcrição-como efetoras (contos) da planta patogênica xanthomonas gêneros e os procariotas cluster regularmente interspaced repete palindrômicas curtas (CRISPR) system / Cas9 em eficientes nucleases grife específicas do local fez gene alvo em células-tronco pluripotentes uma acessível e metodologia praticável ^10-13.

Um artigo recente descreveu um método eficiente para a integração estável de uma cassete repórter fluorescente no AAVS1 porto seguro locus iPSCs humanos utilizando nucleases Tale (TALENS) ^14. Essas iPSCs direcionados mantiveram sua fluorescência mesmo após a diferenciação direcionado para cardiomiócitos e transplante em um modelo de rato de infarto do miocárdio (MI), proporcionando uma forte evidência para a utilidade de talestavelmente células estaminais pluripotentes fluorescente ^14. Para obter colónias específicas, um método gene armadilha foi utilizado em que um aceitador de splicing (SA), 2A sequência do péptido de auto-clivagem coloca a puromicina N-acetil-transferase gene (PAC) sob o controlo do promotor endógeno PPP1R12C; assim, apenas iPSCs que tenham incorporado o ADN dador no locus AAVS1 expressar PAC, tornando-os selecionáveis ​​baseado em puromicina-resistência; (Figura 1, ^15). Este protocolo detalha os procedimentos de geração de AAVS1-GFP iPSCs relatado no recente documento ^14, incluindo o processo de transfecção de iPSCs com TALENS e um doador de 9,8 kb para integrar um fragmento de DNA 4.2kb no locus AAVS1 porto seguro, a seleção de iPSCs com base em picking colônias para a expansão clonal �puromicina-resistência, e. As técnicas aqui descritas podem ser aplicadas a diversos experimentos de engenharia genoma.

Protocol

1. Preparação da Membrana Basal Matrix e Revestimento de Plasticware Colocar a membrana basal estoque matriz congelada de -20 ° C em gelo e descongelar durante a noite a 4 ° C. Após o descongelamento, pipeta 2 mg alíquotas de matriz da membrana basal em tubos Eppendorf de pré-refrigerados. Armazenar estes a -20 ° C até ser necessário. Para preparar placas revestidas com matriz da membrana basal, descongelar uma alíquota sobre o gelo até o último pedaço de gelo nas desaparece …

Representative Results

A visualização do protocolo é fornecido na Figura 2, com períodos em que iPSCs são cultivados em meio diferente destaque por qualquer verde para E8 ou azul para NutriStem. É importante para transfectar apenas iPSCs de alta qualidade; examinar placas de cultura em toda a manutenção de rotina e verificar que as culturas IPSC conter colônias principalmente distintos portadores de uma morfologia de paralelepípedos-like (Figura 3A); células diferenciadas não deve ocupar mais do q…

Discussion

Os passos mais críticos para a geração bem sucedida de AAVS1 porto seguro alvejado iPSCs humanos são: (1) a entrega eficiente TALEN e doadores plasmídeos em iPSCs por transfecção; (2) optimização de dissociação iPSCs em células individuais antes da transfecção e chapeamento densidade após transfecção; (3) a optimização da dose e do tempo de selecção de droga com base no crescimento da linha iPSC; (4) cuidadosamente dissecar e escolhendo colônias direcionados e transferindo a nova placa / poço. Em …

Materials

NAME OF MATERIAL/EQUIPMENT	COMPANY	CATALOG #	COMMENTS/DESCRIPTION
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-Free, 10mL	Corning	354230	Store at -20°C.
DMEM/F-12	Life Technologies	11320-033	Store at 4°C.
Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates	Corning	3506
Essential 8 Medium	Life Technologies	A1517001	Store basal medium at 4°C. Store supplement at -20°C.
Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254	Store at room temp. Once dissolved in H2O, store at -20°C.
Sodium Chloride	Sigma	S5886-500G
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0	Life Technologies	15575-020
DPBS, no calcium, no magnesium	Life Technologies	14190-250
100mm TC-Treated Culture Dish	Corning	430167
DR4 MEF 2M IRR – Academic	GlobalStem	GSC-6204G	Store in liquid Nitrogen.
DMEM, high glucose, pyruvate	Life Technologies	11995-040	Store at 4°C.
Defined Fetal Bovine Serum, US Origin	HyClone	SH30070.03	Store at -20°C. Thaw at 4°C overnight and aliquot. Store aliquots at -20°C until needed.
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Life Technologies	11140-050	Store at 4°C.
4D-Nucleofector Core unit	Lonza	AAF-1001B	part of the electroporation system
4D-Nucleofector X unit	Lonza	AAF-1001X	part of the electroporation system
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT)	Lonza	V4XP-3024	Upon arrival, remove Primary Cell Solution and supplement and store at 4°C.
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Life Technologies	A1110501	Store at -20°C. Thaw overnight at 4°C and warm an aliquot in a 37°C water bath before use.
NutriStem XF/FF Culture Medium	Stemgent	01-0005	Store at -20°C. Thaw overnight at 4°C
AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 and pZT-AAVS1-R1)	Addgene	52637 and 52638
AAVS1-CAG-EGFP Homologous Recombination donor	Addgene	22212
Puromycin Dihydrochloride	Life Technologies	A11138-03	Store at -20°C. Prepare working aliquots of 1 mg/mL in ddH2O.
Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets	Fisher Scientific	13-678-20A
Sorvall Legend XTR (Refrigerated), 120V 60Hz	Thermo Scientific	75-004-521
TX-750 4 × 750mL Swinging Bucket Rotor	Thermo Scientific	75003607
Trypan Blue Solution, 0.4%	Life Technologies	15250-061