Indagare Mast Cellula secretoria Granuli; dal Biosintesi a Esocitosi

Sommario

L'obiettivo del presente protocollo è stato quello di sviluppare un metodo che permetterà analisi di genomica funzionale della secrezione mastociti. Il protocollo si basa sulla valutazione quantitativa del rilascio di un gene reporter fluorescente cotrasfected con il gene di interesse e l'analisi in tempo reale della morfologia del granulo secretorio.

Abstract

Mastociti (MC) sono cellule secretorie del sistema immunitario che svolgono le loro funzioni fisiologiche e patologiche rilasciando mediatori allergici, infiammatorie e immunomodulanti preformati e di nuova sintesi. Mediatori MCs 'riguardano diversi tessuti e organi che culminano nelle risposte allergiche e immunitarie. La sintesi, lo stoccaggio e il rilascio dei mediatori MC sono altamente regolamentati. I mediatori preformati sono confezionati in granuli secretori citoplasmatici (SG), che si fondono con la membrana plasmatica e rilasciano il loro contenuto per esocitosi regolata. Presentiamo un protocollo, basata sulla co-espressione di un gene di interesse con un gene reporter che si rivolge alla SGS e viene rilasciato in modo regolato fianco dei mediatori endogeni SG. Il protocollo consente di alta risoluzione quattro confocale tridimensionale analisi del MC SGS e il controllo della loro linea temporale dal biogenesi a esocitosi innescato. Così, con questo protocollo per lo screening dei geni di Interest per il loro impatto fenotipica e funzionale permette di decifrare i meccanismi molecolari che regolano la biogenesi e esocitosi del MC SGS e identificare i regolatori coinvolti. In tal modo, dovrebbero essere fornite ulteriori informazioni sui meccanismi cellulari che rappresentano la funzione MCs in salute e malattia.

Introduzione

Mastociti (MC) sono cellule immunitarie che sono più noti per il loro coinvolgimento nelle reazioni allergiche e infiammatorie come l'artrite, l'asma, esofagite eosinofila, dermatite cronica e shock anafilattico ^1,2 così come altre patologie tra cui la malattia coronarica e ^3,5 cancro ^3,4. Inoltre, MCs svolgono un ruolo importante in innata e adattativa, sia in difesa dell'ospite contro i batteri e parassiti e dalla soppressione delle risposte immunitarie, ad esempio inducendo la tolleranza dell'organo trapiantato ^5,6.

MCs provengono dal midollo osseo, lo sviluppo di CD34 + / CD1....

Protocollo

1. Preparazione di RBL Cellulari Media Cultura

1. Mescolare 500 ml di mezzo modificato Eagle glucosio basso di Dulbecco (DMEM) con 56 ml di siero fetale bovino (questo fa 10% FBS), e poi aggiungere 5,5 ml di penicillina streptomicina (questo fa ~ 1% PEST).
2. Filtrare il mezzo utilizzando 500-1000 ml Bottle-Top Filtri vuoto con 0,22 micron dimensione dei pori e conservare a 4 ° C.

2. coltura di cellule RBL

1. Grow cellule RBL in atmosfera umidificata al 5% di CO ₂ a 37 ° C sia in lastre o flaconi. Cellule RBL che stanno crescendo in 10 centimetri piastre devono essere integrati con 10 ml di media e ....

Risultati

A causa della bassa efficienza di trasfezione di MC, manipolazioni genetiche è improbabile che lasciare un impatto sulle letture di secrezione media misurate dai mediatori endogeni SGS. Tuttavia, stabilendo completa co-espressione del gene reporter NPY-MRFP e il plasmide co-trasfettato nelle stesse cellule, monitoraggio dei risultati NPY-MRFP nel monitoraggio esclusivamente popolazione cellulare che esprime il gene di interesse. Pertanto, il vantaggio di questo test rispetto ai metodi convenzionali è la capacità di cont.......

Discussione

Descriviamo una strategia innovativa che combina la quantificazione di MCs esocitosi e quattro (x, y, z, t) quantificazioni dimensione da immagini tridimensionali e ritardi delle SG in cellule viventi con un gene reporter per esocitosi. Questa tecnica consente proiezione di famiglie di proteine ​​per il loro impatto sulla funzione MC come SGs monitoraggio inizio già a loro uscita dal Golgi attraverso la loro maturazione, acquisizione di competenze esocitosi e degranulazione. La combinazione di misure di esocitosi insiem.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DMEM	Sigma-Aldrich	D6046-500ML	Caldo in 37 gradi C bagno d'acqua prima dell'uso
Fetale Bovino Siero	GE assistenza sanitaria Scienze della vita	SH30071.01
Penicillina-Streptomicina	Tecnologie
Membrana in acetato di cellulosa, dimensione dei pori 0,22   μ m	Sigma-Aldrich	CLS430769-1EA
Piastre di coltura trattate con coltura tissutale Corning	Sigma-Aldrich	CLS430167
Soluzione di tripsina/EDTA (TE)	Tecnologie di vita	R001100	Warm in 37 ° C bagnomaria prima dell'uso
TUBI sale dipotassico	Sigma-Aldrich	108321-27-3
Acetato di calcio idrato	Sigma-Aldrich	114460-21-8
Acetato di magnesio tetraidrato	Sigma-Aldrich	M5661
Acido L-glutammico sale di potassio monoidrato (glutammato di potassio)	Sigma-Aldrich	G1501
4 mm elettroporazione cuvette	progetti cellulari	EP-104
GENE PULSER CON CONTROLLER DI IMPULSI & CAPACITANCE	Bio rad
Coverglass a camera	Thermo scientific	155411
24 pozzetti, fondo piatto	Sigma-Aldrich	CLS3524
Corning Piastre a 96 pozzetti	Sigma-Aldrich	CLS3367 o CLS390
Lettore di fluorescenza per piastre a 96 pozzetti - Infinite 200	Tecan
Calcium ionoforo A23187	Sigma-Aldrich	C7522	Evitare dall'esposizione diretta alla luce
12-O-tetradecanoyl-13-acetato (TPA)	Calbiochem	P3766
anti-DNP monoclonale IgE	Sigma-Aldrich	D8406
DNP-BSA/ DNP-HAS	Sigma-Aldrich	A6661	Evitare l'esposizione alla luce diretta
Triton-x-100	Sigma-Aldrich	T8787
Microscopio confocale fluorescente:
Zeiss LSM 510
Leica	SP5
Nikon A1 invertito
Software Imaris	BITLANE
Microsoft exel o Prism o altri software
Altri reagenti:
Cloruro di magnesio	MERK	5833
Cloruro di sodio	MERK	6404
Cloruro di calcio	MERK	2382
Albumina sierica bovina	Sigma-Aldrich	A4503
Glucosio	BDH Laboratories	284515V
Fosfato monosodico	MERK	5345
Acqua

di vitadi analisi sterile