Исследование тучных клеток секреторных гранул; от биосинтеза к экзоцитозу
Summary
Целью настоящего протокола заключается в разработке способа, который позволит функциональные геномные анализы секреции тучных клеток. Протокол основан на количественной оценке высвобождения флуоресцентного гена-репортера cotrasfected с интересующего гена и реального времени анализа морфологии секреторной гранулы в.
Abstract
Тучных клеток (MC) являются секреторные клетки иммунной системы, которые выполняют свои физиологические и патологические функции, выпуская предварительно сформированных и вновь синтезированных аллергических, воспалительных и иммунорегуляторных медиаторов. Посредники MCS "влияют несколько тканей и органов кульминацией аллергических и иммунных реакций. Синтез, хранение и выпуск медиаторов MC высоко регулируется. Предварительно формируется посредники упаковываются в цитоплазматические секреторных гранул (SG), что сливаются с плазматической мембраной и высвобождают их содержимое, регулируемой экзоцитоза. Мы представляем протокол, основанный на совместной экспрессии интересующего гена с геном-репортером, которая предназначена для ИК и выпущен в регулируемом образом наряду с эндогенными посредниками SG. Протокол позволяет с высоким разрешением четырехмерный конфокальной анализы MC ПГ и контроля за их сроки от биогенеза, чтобы срабатывает экзоцитоза. Таким образом, используя этот протокол для скрининга генов ИнтерТекущая за их фенотипического и функционального воздействия позволяет расшифровать молекулярные механизмы, которые регулируют биогенез и экзоцитоз МК ПГ и выявление регуляторов, участвующих. Таким образом, должна быть обеспечена более полное представление о клеточных механизмах, которые составляют функции MCS в норме и патологии.
Introduction
Тучные клетки (ТК) являются иммунные клетки, которые лучше всего известны за их участие в аллергических и воспалительных реакций, таких как артрит, астма, эозинофильный эзофагит, хронический дерматит и анафилактический шок 1,2, а также других патологий, включая болезнь коронарных артерий 3,5 и Рак 3,4. Кроме того, МС играют важную роль в врожденного и адаптивного иммунитета, как в иммунной защиты против бактерий и паразитов и подавления иммунного ответа, например, индуцирующего аллотрансплантата толерантности 5,6.
МС происходят из костного мозга, развивается от CD34 + / CD117 + плюрипотентные клетки-предшественники 7. Совершенные костного мозга MC предшественники попадают в кровь и мигрируют в периферические ткани локализовать преимущественно в соединительной ткани и эпителиальные поверхности 8. Созревание и терминальная дифференцировка, в конечном итоге достигается под влиянием OF цитокины в пределах окружающей среде 8,9.
МС может быть активирован аллергена (антигена, Ag), чья встреча привела к образованию иммуноглобулина Е (IgE) тип антител. Связывание такой IgE к FcεRI рецепторов МК, за ними следуют сшивания клеток, связанного IgE при повторном воздействии того же Ag, приводит к FcεRI агрегации и начала сигнального каскада, который завершается в дегрануляции ячейки [рассмотрены в 10,11] , МС также активируются, независимо от IgE, по нейропептидов 5,12, токсины 13, бактериальных и вирусных антигенов 14,15, количество положительно заряженных пептидов совместно именуемые основных секреции, иммунных клеток и цитокинов 5,13,12,16 17. МС также активируется многие из их собственных выпущенных медиаторов, которые дополнительно усиливают воспалительную реакцию.
МС упакованы с секреторных гранул (SGS), которые содержат иммунорегулирующих посредники, в том числе вазоактивных аминов, таких как гистамин и серотонин (у грызунов), протеогликанов, протеаз, таких как химазы и триптазы, фактора роста эндотелия сосудов и нескольких цитокинов и хемокинов 8,9. Эти посредники "готов пойти" и один раз МС активируются соответствующего стимула, эти посредники освобождаются из клеток регулируется экзоцитоза (дегрануляции) в течение нескольких секунд до минут 18,19. Это исходное событие следует путем синтеза De Novo и выделением большого массива биологически сильнодействующих веществ, в том числе метаболитов арахидоновой кислоты, несколько цитокинов и хемокинов 20,21,22. Выпуск новых синтезированных продуктов происходит независимо от выпуска SG. В совокупности эти посредники инициировать ранние и поздние фазы воспалительных и аллергических реакций. Таким образом, понимание механизмов, учитывающие MC активации и дегрануляции оба из теоретической и клинической импortance.
Трудность генетически манипулировать первичных и культурные МС препятствует попыткам выяснения механизмов, лежащих в основе MC дегрануляцию, которые были плохо решены. Чтобы преодолеть эту проблему, мы разработали на основе анализа репортерного СО-трансфекции линии тучных клеток слизистой оболочки, крысы базофильной лейкемии (RBL) -2H3 (отнесено здесь к RBL) или костного мозга, полученные МС (ВММС) 30 с интересующего гена и нейропептида Y (NPY), слитый с мономерной RFP (MRFP), как SG репортера.
NPY Ранее было показано, воспроизводят поведение эндогенных маркеров SG в других системах. Кроме того, из-за флюоресценции MRFP является нечувствительным рН, выражение NPY-MRFP позволяет визуализировать кислотных ИК, а также количественную оценку с помощью экзоцитоза 96-луночные планшеты и устройства чтения флуоресценции пластины. Мы показали, что NPY-MRFP доставляется в кислых ИК в RBL-клеток и ВММС и высвобождается из клетокна регулируемом моды наряду с эндогенным SG груза (например, β-гексозаминидазы и серотонина) 30, 32. Этот протокол обеспечивает изображения на основе методологии высокого разрешения, что позволяет скрининга генов, представляющих интерес для их фенотипических и функциональных влияния на характеристики SG и дегрануляции в RBL клеток 32. В частности, этот протокол позволяет в режиме реального времени отслеживать MC ПГ и количественную оценку их области или размера тома, их номера, кинетики сборки, их движения по мобильному цитоскелета и их конечной слияния с плазматической мембраной при различных условиях. Например, сенсибилизации клеток с DNP-специфического IgE и запуск клетки с поливалентной Ag (DNP конъюгированный сывороточный альбумин) при различных возмущений (то есть, нокдаун генов, представляющих интерес, более экспрессии мас или мутантных генов, или фармакологических манипуляций) и по сравнению с контрольными клетками.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы описываем инновационной стратегии, которая сочетает в себе количественную МКС экзоцитоза и четыре (X, Y, Z, т) Размер количественными по времени истек трехмерной визуализации ИК в живых клетках с использованием ген-репортер для экзоцитоза. Этот метод позволяет просмотр семейств белко…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим доктора У. поташа за дар NPY-MRFP кДНК. Мы благодарим доктора. MJ Kofron, Л. Mittleman, М. Shaharbani, Е. Зильберштейн за неоценимую помощь в микроскопии и анализ изображения. Мы также благодарим д-р Джозеф Орли за критическое прочтение рукописи. Эта работа была поддержана грантом Научного фонда Израиля, основанной Израиля академии наук (1139/12 к RS-Е.).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6046-500ML | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum | GE health care Life sciences | SH30071.01 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies | ||
| Cellulose acetate membrane, pore size 0.22 μm | Sigma-Aldrich | CLS430769-1EA | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Life technologies | R001100 | Warm in 37 °C water bath before use |
| PIPES dipotassium salt | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Calcium acetate hydrate | Sigma-Aldrich | 114460-21-8 | |
| Magnesium acetate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate (Potassium glutamate) | Sigma-Aldrich | G1501 | |
| 4 mm electroporation cuvettes | cell projects | EP-104 | |
| GENE PULSER WITH PULSE CONTROLLER & CAPACITANCE | Bio rad | ||
| Chambered coverglass | Thermo scientific | 155411 | |
| 24 well, flat bottom | Sigma-Aldrich | CLS3524 | |
| Corning 96 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3367 or CLS390 | |
| 96 well plate fluorescence reader- Infinite 200 | Tecan | ||
| Calcium ionophore A23187 | Sigma-Aldrich | C7522 | Avoid from direct light exposure |
| 12-O-tetradecanoyl-13-acetate (TPA) | Calbiochem | P3766 | |
| anti-DNP monoclonal IgE | Sigma-Aldrich | D8406 | |
| DNP-BSA/ DNP-HAS | Sigma-Aldrich | A6661 | Avoid from direct light exposure |
| Triton-x-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Confocal fluorescent microscope: | |||
| Zeiss LSM 510 | |||
| Leica | SP5 | ||
| Nikon A1 inverted | |||
| Imaris software | BITLANE | ||
| Microsoft exel or Prism or other analyses software | |||
| Other reagent: | |||
| Magnesium Chloride | MERK | 5833 | |
| Sodium chloride | MERK | 6404 | |
| Calcium chloride | MERK | 2382 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Glucose | BDH Laboratories | 284515V | |
| Monosodium phosphate | MERK | 5345 | |
| Sterile water |
Riferimenti
- Abonia, J. P., et al. Involvement of mast cells in eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 126 (1), 140-149 (2010).
- Galli, S. J., Tsai, M. Mast cells in allergy and infection: versatile effector and regulatory cells in innate and adaptive immunity. Eur J Immunol. 40 (7), 1843-1851 (2010).
- Ribatti, D., Crivellato, E. The controversial role of mast cells in tumor growth. International Review of Cell and Molecular Biology. 275, 89-131 (2009).
- Ribatti, D., Crivellato, E. Mast cells, angiogenesis and cancer. Adv Exp Med Biol. 716, 270-288 (2011).
- Tsai, M., Grimbaldeston, M., Galli, S. J. Mast cells and immunoregulation/immunomodulation. Adv Exp Med Biol. 716, 186-211 (2011).
- Vries, V. C., Noelle, R. J. Mast cell mediators in tolerance. Curr Opin Immunol. 22 (5), 643-648 (2010).
- Kirshenbaum, A. S., et al. Demonstration that human mast cells arise from a progenitor cell population that is CD34(+), c-kit(+), and expresses aminopeptidase N (CD13). Blood. 94 (7), 2333-2342 (1999).
- Metcalfe, D. D., Baram, D., Mekori, Y. A. Mast cells. Physiol Rev. 77 (4), 1033-1079 (1997).
- Gilfillan, A. M., Austin, S. J., Metcalfe, D. D. Mast cell biology: introduction and overview. Adv Exp Med Biol. 716, 2-12 (2011).
- Rivera, J., Gilfillan, A. M. Molecular regulation of mast cell activation. J Allergy Clin Immunol. 117 (6), 1214-1225 (2006).
- Rivera, J., Gilfillan, A. M. Molecular regulation of mast cell activation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 117 (6), 1214 (2006).
- Lagunoff, D., Martin, T. W., Read, G. Agents that release histamine from mast cells. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 23, 331-351 (1983).
- Depinay, N., Hacini, F., Beghdadi, W., Peronet, R., Mecheri, S. Mast cell-dependent down-regulation of antigen-specific immune responses by mosquito bites. J Immunol. 176 (7), 4141-4146 (2006).
- Abel, J., et al. Staphylococcus aureus evades the extracellular antimicrobial activity of mast cells by promoting its own uptake. J Innate Immun. 3 (5), 495-507 (2011).
- Avila, M., Gonzalez-Espinosa, C. Signaling through Toll-like receptor 4 and mast cell-dependent innate immunity responses. IUBMB Life. 63 (10), 873-880 (2011).
- Novak, N., Bieber, T., Peng, W. M. The immunoglobulin E-Toll-like receptor network. Int Arch Allergy Immunol. 151 (1), 1-7 (2010).
- Rudich, N., Ravid, K., Sagi-Eisenberg, R. Mast cell adenosine receptors function: a focus on the a3 adenosine receptor and inflammation. Front Immunol. 3, 134 (2012).
- Theoharides, T. C., Kempuraj, D., Tagen, M., Conti, P., Kalogeromitros, D. Differential release of mast cell mediators and the pathogenesis of inflammation. Immunol Rev. 217, 65-78 (2007).
- Caughey, G. H. Mast cell proteases as protective and inflammatory mediators. Adv Exp Med Biol. 716, 212-234 (2011).
- Lundequist, A., Pejler, G. Biological implications of preformed mast cell mediators. Cell Mol Life Sci. 68 (6), 965-975 (2011).
- Metz, M., Maurer, M. Mast cells–key effector cells in immune responses. Trends Immunol. 28 (5), 234-241 (2007).
- Gordon, J. R., Burd, P. R., Galli, S. J. Mast cells as a source of multifunctional cytokines. Immunol Today. 11 (12), 458-464 (1990).
- Azouz, N. P., Matsui, T., Fukuda, M., Sagi-Eisenberg, R. Decoding the regulation of mast cell exocytosis by networks of Rab GTPases. J Immunol. 189 (5), 2169-2180 (2012).
- Stenmark, H., et al. Inhibition of rab5 GTPase activity stimulates membrane fusion in endocytosis. EMBO J. 13 (6), 1287-1296 (1994).
- Azouz, N. P., et al. Rab5 is a novel regulator of mast cell secretory granules: impact on size, cargo, and exocytosis. J Immunol. 192 (9), 4043-4053 (2014).
