Experimentelle Bewertung der Maus Sociability einer automatisierten Bildverarbeitung Ansatz

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode Maus Kontaktfreudigkeit zu quantifizieren. Die Mäuse werden auf Video aufgezeichnet, wie sie in einem speziellen Käfig bewegen und interagieren. Filmverarbeitung ermöglicht die automatisierte Quantifizierung von Gesellschaftlichkeit mit ausgezeichneter Genauigkeit und Zuverlässigkeit.

Abstract

Maus ist das bevorzugte Modellorganismus für Medikamente entwickelt, zu erhöhen Kontaktfreudigkeit zu testen. Wir stellen eine Methode Maus Kontaktfreudigkeit zu quantifizieren, in dem die Testmaus in einem standardisierten Gerät gestellt wird und relevante Verhaltensweisen werden in drei verschiedenen Sitzungen beurteilt (die so genannte Session I, II und III).

Das Gerät verfügt über drei Fächer (siehe Abbildung 1), die linken und rechten Kammern eine umgekehrte Schale enthalten , die eine Maus aufnehmen kann ( "Stimulus Maus" genannt).

In Sitzungs I, wird der Test der Maus in den Käfig gegeben und seine Beweglichkeit wird durch die Anzahl von Übergängen, die zwischen Kammern gekennzeichnet. In Session II wird ein Stimulus Maus unter einer der invertierten Tassen und die Kontaktfreudigkeit der Test Maus wird durch die Höhe der Zeit , es verbringt in der Nähe der Tasse gegen den leeren umgekehrten Schale enthält die beiliegende Stimulus Maus quantifiziert platziert. In Session III werden die umgekehrten Becher entfernt ein d beide Mäuse frei interagieren. Die Geselligkeit der Test Maus in der Sitzung III wird durch die Anzahl der sozialen Ansätze quantifiziert es der Reiz Maus macht zu und durch die Anzahl der Zeiten vermeidet es einen sozialen Ansatz durch den Reiz der Maus.

Die automatisierte Auswertung des Films erkennt die Nase des Testmaus, die die Bestimmung aller beschriebenen Kontaktfreudigkeit Maßnahmen in der Sitzung I und II ermöglicht (in der Sitzung III werden Ansätze automatisch identifiziert, aber klassifiziert manuell). Um die Nase, das Bild eines leeren Käfig finden wird digital von jedem Frame des Films abgezogen und das resultierende Bild wird digitalisiert die Maus Pixel zu identifizieren. Die Maus Schwanz wird automatisch entfernt und die beiden am weitesten entfernten Punkte der verbleibenden Maus bestimmt werden; diese sind in der Nähe der Nase und der Basis des Schwanzes. Durch die Analyse der Bewegung der Maus und der Kontinuität Argumente wird die Nase identifiziert.

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Abbildung 1. Bewertung der Sociability Während drei Sitzungen Session I (oben):.. Akklimatisierung von Test Maus in den Käfig Session II (Mitte). Test – Maus frei im Käfig bewegt , während der Reiz Maus in einer umgekehrten Schale eingeschlossen ist Session III (unten): Beide Test Maus und Stimulus-Maus erlaubt frei miteinander und interagieren zu bewegen.

Introduction

Impaired Kontaktfreudigkeit ist eine der primären Symptom – Domänen in einer Reihe von Störungen der neurologischen Entwicklung, einschließlich Autismus – Spektrum – Störungen (ASD) ^1,2. Es schränkt die Fähigkeit der Patienten , Beziehungen zu entwickeln und stark beeinflusst Patienten, Familien und Betreuer ^2,3.

In dem Bemühen, besser den Mechanismus verstehen beeinträchtigt Kontaktfreudigkeit zugrunde liegenden und zu entwickeln Behandlungen wurden mehrere Mausmodelle ^1,4-9 untersucht. Ein solcher Stamm ist der Balb / c – Maus, ein Inzuchtstamm , die auffallend niedrige Kontaktfreudigkeit zeigt, ähnlich Funktionen bei Patienten mit ASD5 ^8-12 gesehen. Zum Beispiel zeigt die Balb / c – Maus eine niedrigere Frequenz der sozialen Ansätzen und einer in der Regel negativen Antwort auf die sozialen Ansätze durch einen Reiz Maus (zB soziale Vermeidung) als der Schweizer Webster Komparator Stamm ^10.

Um zu testen, ob eine vorgeschlagene Behandlung ist effective bei der Steigerung sind Kontaktfreudigkeit, objektive Maßnahmen erforderlich. Eine weithin akzeptierte Rahmen ist die Geselligkeit in einem standardisierten Gerät zu analysieren , die drei Fächer hat (siehe Abbildung 1).

Die linke und rechte Kammern enthalten jeweils einen invertierten Draht Tasse, die eine sozial ausgeprägten Reiz Maus beherbergt. Der Test Maus ist für drei Intervallen von 10 min (Sitzungen I-III) in das Gerät freigesetzt; Sitzung I beurteilt die Bewegungsaktivität der Test Maus, während Sitzungen II und III verschiedene Aspekte des Geselligkeits-Test Maus beurteilen.

In Session I, wird der Test Maus an das Gerät akklimatisieren. In dieser Sitzung, die die Anzahl von Übergängen der Test Maus zwischen den verschiedenen Abteilen ermöglicht wird gemessen. Wichtig erhalten, Kontaktfreudigkeit Maßnahmen in der Standard-Drei-Kammer-Gerät auf die Bewegungsaktivität abhängig sind, und reduziert die Bewegungsaktivität kann Interpretation von soci vermengenFähigkeit, Daten.

In Session II wird die Test Maus frei bewegen und ein Reiz Maus wird unter einer der invertierten Tassen platziert (ausgeglichen). Die Stimulus-Mäuse sind 4 Wochen alte männliche ICR outbred Mäuse, Alter und Geschlecht abgestimmt auf die Testmäuse. Der Reiz der Maus wird in einer umgekehrten Schale in der Seite bezeichnet als Sozialraum eingeschlossen ist, und eine leere umgekehrten Schale ist in der Seiten bezeichnet als nonsocial Fach gelegt. In Session II wird die Kontaktfreudigkeit des Test Maus durch einen Vergleich der Zeit , es in der Nähe des "sozialen" Inverted Cup verbringt quantifiziert (weniger als 2 cm entfernt) gegen die Zeit, in der Nähe des "nonsocial" Inverted Cup, und durch die Zeit verbringt sie verbringt im Sozialraum gegen die Zeit, in der nonsocial Raum verbringt. Swiss Webster Komparator Mäuse verbringen deutlich mehr Zeit im sozialen Raum und in der Nähe der sozialen umgekehrten Schale im Vergleich zu Balb / c-Mäusen, die keine signifikante Präferenz für die soziale zeigenInverted Cup oder die soziale Fach ^12.

In Session III, Test und Stimulus Mäuse sind erlaubt, frei zu interagieren (invertiert Tassen werden entfernt). Maßnahmen der Geselligkeit, Stereotypien Verhaltensweisen und Übergänge zwischen den Kammern werden zuverlässig in der dritten 10 min Sitzung der freien Interaktion zwischen Test und Stimulus Mäusen erhalten und analysiert. In diesem Bericht wird die Kontaktfreudigkeit der Test Maus über zwei Maßnahmen quantifiziert: 1) die Anzahl der sozialen Ansätze es in Richtung der Reiz Maus macht, wo eine soziale Ansatz als vorwärts definiert (Nase zuerst) in Richtung der Reiz Maus, so dass die Nase weniger als 2 cm entfernt von der Stimulus-Maus; 2) die Anzahl der Vermeidungen sozialer Ansätze durch den Stimulus Maus. Der Test Maus gilt als Ansatz zu vermeiden, wenn es dreht oder bewegt sich von der Stimulus Maus weg, oder wenn es vorübergehend außer Betrieb ( "Einfrieren Verhalten") nach dem Stimulus Maus zu bewegen hat den Test der Maus angefahren. BALB /c – Mäuse zeigen eine Abnahme der Zahl der sozialen Ansätze gemacht gegenüber dem Stimulus – Maus und eine Erhöhung der Zahl der negativen Reaktionen auf soziale Ansätze durch den Reiz der Maus im Vergleich zum Swiss – Webster – Komparator – Stamm ^10.

Die Auswertung der Verhaltens Filme wurde traditionell manuell durchgeführt worden, dh durch den Film (möglicherweise mit reduzierter Geschwindigkeit) sorgfältig zu beobachten und Stoppuhren für die Zeit , die Maus verbringt in einem bestimmten Fach oder in der Nähe eines der invertierten Becher ¹⁰ zu aktivieren. Dieses Verfahren erfordert wiederholt des Films beobachtet und ist daher sehr zeitraubend. Außerdem wird die Genauigkeit durch die Rater die Reaktionszeit für die Stoppuhr-Messungen und die Fähigkeit zu erkennen, beschränkt, ob die Maus innerhalb von 2 cm von der umgekehrten Schale ist. In den letzten Arbeiten, zwei Verbindungen (D-Serin und D-Cycloserin) haben bei der Wiederherstellung Umgänglichkeit in BALB / c – Mäuse ^9,10,12 wirksam erwiesen. Es ist bekannt, dass beide Komponenten moduEnde der NMDA – Rezeptor, der bekannt ist , eine zentrale Rolle im Sozialverhalten ^2,12 zu spielen. NMDA-Rezeptor-Aktivität in einer Vielzahl von wohldefinierten Weise, und das Potential für einen Durchbruch in ASD-Behandlung Eine große Reihe von Verbindungen ist bekannt, zu modulieren, macht die beschleunigte Bewertung dieser Verbindungen eine Priorität und eine schnelle automatische Methode zur Auswertung sehr wünschenswert.

Nachstehend wird ein automatisches Analyseverfahren für die Beurteilung der Maus Soziabilität entwickelt. Es verwendet Bildverarbeitungsverfahren auf alle Rahmen der Maus Filme der Position der Maus oder Mäuse zu identifizieren. In Sitzungen I und II, sie erkennt weiter Nasenposition und verwendet sie Soziabilität Maßnahmen zu berechnen. In Session III, erkennt er automatisch alle Ansätze, aber manuelle Klassifizierung (soziale Ansatz, soziale Vermeidung oder andere) erforderlich.

Protocol

Das Protokoll für die Vereinfachung der Erläuterung wurde in 2 Teile geteilt: 1) Versuchsdurchführung und 2) Automatisierte Analyse. Alle Tiere wurden nach dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren 15 behandelt, und alle Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt. 1. Experimentelles Verfahren Stellen Sie den Käfig, der eine schwarze entspiegelte Plexiglas rechteckigen Kasten (52 x 25 x 23 cm 3) gliede…

Representative Results

Abbildung 3 zeigt einen Farbrahmen eines Verhaltens Film mit einem leeren Käfig. Die Maus hat in den Käfig eingeführt bisher noch nicht. Die Position der Schalen, (soziale und nonsocial) und die Kompartimentgrenzen überlagert werden. Der Farbrahmen von leeren Käfig ist auf 8 Bit – Graustufen umgewandelt , wie in Abbildung 4 und verwendet als Referenzrahmen gezeigt. Der Referenzrahmen wird von jedem anderen Bild des aufgenommenen Film abgezogen. …

Discussion

Durch die Kombination von Mäusen und automatischen Filmanalyse videotaping haben wir eine erschwingliche, zuverlässige Hochdurchsatz-Screening-Technik erstellt.

Die Genauigkeit der automatisierten Analyse wurde für mehr als 100 Filme mit den Ergebnissen der manuellen Analyse verglichen. In der überwiegenden Mehrzahl von Rahmen (> 99%) von Vollbildern wird die Nase der Maus mit guter Präzision identifiziert. Die meisten der (wenigen) Fehldetektionen haben keine Auswirkungen auf die Ko…

Materials

Plexiglas cage	Norva Plastics, Norfolk, VA	custom made	Dimensions and layout described in manuscript, can be adjusted according to needs. Use non-reflective plexiglas for to facilitate image processing
Wire cups	Kitchen plus	315	Use one to house stimulus mouse, one empty
Video camera	SONY	HDR-PJ790	Can be replaced by any camera with Comparable specifications
OpenCV (Image processing library)	Willow Garage	N/A	Any modern image processing library can be used.