Eksperimentell Vurdering av Mouse Omgjengelighet hjelp av en automatisert bildebehandling Approach

Summary

Denne protokollen beskriver en metode for å kvantifisere mus omgjengelighet. Mus er filmet mens de beveger seg og samhandle i en spesiell bur. Film behandling gir mulighet for automatisert kvantifisering av omgjengelighet med god nøyaktighet og pålitelighet.

Abstract

Mus er den foretrukne modellorganisme for å teste narkotika utviklet for å øke omgjengelighet. Vi presenterer en metode for å kvantifisere mus sociability som testen mus blir plassert i et standardisert anordning og relevante adferd vurderes i tre forskjellige sesjoner (kalt sesjon I, II og III).

Apparatet består av tre kamre (se figur 1), på venstre og høyre kamre inneholder en omvendt kopp som kan huse en mus (kalt "stimulus mus").

I sesjon I, blir test mus plassert i buret og dets mobilitet er karakterisert ved antallet av overganger gjort mellom kamrene. I sesjon II, er en stimulans mus plassert under en av de inverterte kopper og omgjengelighet av test musen er kvantifisert med beløpene tid det tilbringer nær koppen med vedlagte stimulans mus vs. tom omvendt kopp. I sesjon III, er de inverterte kopper fjernet en d både mus samhandle fritt. Omgjengelighet av test musen i økten III er kvantifisert med antall sosiale tilnærminger det gjør mot stimulus musen og med antall ganger den unngår en sosial tilnærming ved stimulans musen.

Den automatiserte evaluering av filmen oppdager nesen av testen mus, som tillater bestemmelse av alle beskrevet omgjengelighet tiltak i økten I og II (i session III, er tilnærminger identifiseres automatisk, men klassifisert manuelt). For å finne nesen, er bildet av en tom bur digitalt trekkes fra hver ramme av filmen og den resulterende bildet er binærisert å identifisere musen piksler. Den musehale blir automatisk fjernet, og de to mest fjerntliggende steder av de gjenværende mus bestemmes; disse er i nærheten nese og undersiden av halen. Ved å analysere musens bevegelse og ved hjelp av kontinuitets argumenter blir nesen identifisert.

"Figur 1" src = "/ files / ftp_upload / 52508 / 52508fig1.jpg" />
Figur 1. Vurdering av Omgjengelighet Under 3 økter Session I (øverst):.. Akklimatisering av test musen til buret Session II (i midten). Test musen beveger seg fritt i buret mens stimulans musen er omsluttet av en omvendt kopp Session III (nederst): Både test mus og stimulans mus får lov til å bevege seg fritt og samhandle med hverandre.

Introduction

Nedsatt omgjengelighet er en av de viktigste symptom domener i en rekke nevrologiske lidelser, inkludert autismespekterforstyrrelser (ASDer) ^1,2. Det begrenser alvorlig pasientens evne til å utvikle relasjoner og i stor grad påvirker pasienter, familier og omsorgspersoner ^2,3.

I et forsøk på å bedre forstå mekanismen bak svekket omgjengelighet og utvikle behandlinger, har flere musemodeller studert ^1,4-9. En slik belastning er BALB / c mus, en innavlet stamme som viser påfallende lav omgjengelighet, likner funksjonene sett hos pasienter med ASD5 ^8-12. For eksempel viser BALB / c mus en lavere frekvens av sosiale tilnærminger og en vanligvis negativ respons på sosiale tilnærminger av en stimulus mus (f.eks sosial unngåelse) enn den sveitsiske Webster komparator belastning ^10.

For å teste om en foreslått behandling er effective i økende omgjengelighet, er objektiv tiltak er nødvendige. Et allment akseptert rammeverk er å analysere den sociability i en standardisert apparat som har tre kamre (se figur 1).

Venstre og høyre avdelinger som hver inneholder en omvendt tråd cup som huser et sosialt fremtredende stimulus mus. Testen mus slippes inn i apparatet for tre intervaller på 10 min (sesjoner I-III); session jeg vurderer bevegelsesaktivitet av test mus, mens sesjoner II og III vurdere ulike aspekter av testen musens omgjengelighet.

I sesjon Jeg er testen musen akklimatiseres til apparatet. I denne sesjonen, er antallet overganger at testen musen gjør mellom de ulike avdelingene målt. Viktigere, omgjengelighet tiltak oppnås i standard tre-kammer apparat er avhengig av lokomotorisk aktivitet, og redusert lokomotorisk aktivitet kan forvirre tolkning av socievne data.

I sesjon II, er testen musen beveger seg fritt og en stimulans musen er plassert under en av de inverterte kopper (motvekts). Stimulanse mus er fire uker gamle outbred ICR hannmus, alders- og kjønns tilpasset testmusene. Den stimulus mus er innesluttet i en omvendt kopp i siden betegnet som sosial rommet, og en tom omvendt kopp er plassert i siden betegnet som nonsocial rommet. I sesjon II, er omgjengelighet av testen muse kvantifisert ved å sammenligne den tiden den tilbringer nærheten av "sosiale" omvendt kopp (mindre enn 2 cm unna) vs. tiden den tilbringer nærheten av "nonsocial" omvendt kopp, og etter den tid den tilbringer i det sosiale rommet vs. tiden den tilbringer i nonsocial rommet. Swiss Webster komparator mus bruke betydelig mer tid i det sosiale rommet og i nærheten av sosial omvendt kopp forhold til BALB / c mus som viser ingen signifikant preferanse for sosialomvendt kopp eller det sosiale rommet ^12.

I sesjon III, er test og stimulans mus lov til å samhandle fritt (inverterte kopper fjernes). Tiltak av omgjengelighet, stereotype atferd og overganger mellom avdelinger er pålitelig oppnådd i tredje 10 min økt med gratis samspill mellom test og stimulans mus og analysert. I denne rapporten er det omgjengelighet av testen muse kvantifisert via to tiltak: 1) antall sosiale tilnærminger det gjør mot stimulus mus, hvor en sosial tilnærming er definert som beveger seg fremover (nese først) mot stimulus musen slik at nesen er mindre enn 2 cm fra stimulus mus; 2) antall unngåelser av sosiale tilnærminger av stimulans musen. Testen mus anses å være å unngå tilnærming hvis det viser eller beveger seg bort fra stimulus mus, eller om det midlertidig stopper å bevege seg ( "frysing atferd") etter at stimulus musen har nærmet test musen. BALB /c-mus viser en nedgang i antall sosiale tilnærminger laget mot stimulus mus og en økning i antall av negative reaksjoner på sosiale tilnærminger av stimulus mus, sammenlignet med den sveitsiske Webster komparator belastning ^10.

Evalueringen av de atferds filmene har tradisjonelt blitt gjort manuelt, dvs. ved å se filmen nøye (muligens med redusert hastighet) og aktivere stoppeklokker for tiden musen bruker i en bestemt avdeling eller i nærheten av en av de inverterte kopper ^10. Denne metoden krever se av filmen gjentatte ganger og er derfor meget tidkrevende. Dessuten er nøyaktig begrenset av den rater reaksjonstid for stoppeklokke målinger og evne til å oppfatte hvorvidt mus er innen 2 cm fra det omvendt kopp. I senere arbeid, to forbindelser, (D-serin og D-cykloserin) har vist seg effektivt for å gjenopprette sociability i BALB / c-mus ^9,10,12. Det er kjent at begge komponenter MODUsent NMDA-reseptoren, som er kjent for å spille en sentral rolle i sosial atferd ^2,12. Et stort utvalg av forbindelser er kjent for å modulere NMDA reseptor aktivitet i en rekke veldefinerte måter, og potensialet for et gjennombrudd i ASD-behandling så rask evaluering av disse forbindelsene en prioritet og en rask automatisk metode for evaluering svært ønskelig.

Beskrevet nedenfor er en automatisk analyse prosedyre utviklet for vurdering av musen omgjengelighet. Den bruker bildebehandlings metoder på alle rammene av musen filmer for å identifisere posisjonen til mus eller mus. I sesjoner I og II, oppdager det videre nese posisjon og bruker den til å beregne omgjengelighet tiltak. I sesjon III, finner den automatisk alle tilnærminger, men manuell klassifisering (sosial tilnærming, sosial unngåelse eller annet) er påkrevd.

Protocol

Protokollen for å lette forklaringen er delt i 2 deler: 1) Eksperimentell prosedyre og 2) Automatisert analyse. Alle dyr ble behandlet i henhold til Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr 15, og alle prosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité. 1. Eksperimentell prosedyre Sett opp buret, noe som er en svart, ikke-reflekterende Plexiglas rektangulær boks (52 x 25 x 23 cm 3) inndelt i tre avdelinger: sosiale, nonsocial, og en nøytra…

Representative Results

Figur 3 viser en farge ramme av en atferdsmessig film med et tomt bur. Musen har ikke blitt introdusert inn i buret ennå. Posisjonen av kopper, (sosiale og nonsocial) og seksjonsgrenser blir overlagret. Fargen rammen av tomme bur blir omdannet til 8-bits gråskala som vist i figur 4 og benyttes som en referanse ramme. Referanserammen er subtrahert fra alle andre ramme av den fangede filmen. Figur 5 viser en av rammene fra filmen under økte…

Discussion

Ved å kombinere videoopptak mus og automatiske filmanalyse, har vi skapt en rimelig, pålitelig høy gjennomstrømming screening teknikk.

Nøyaktigheten av automatisert analyse ble sammenlignet med resultatene fra manuell analyse for mer enn 100 filmer. I det overveldende flertall av rammer (> 99%) av rammer, er nesen til mus identifisert med god presisjon. De fleste av de (få) misdetections har ingen effekt på omgjengelighet tiltak, slik at rundt 80% av filmene ikke krever noen rettel…

Materials

Plexiglas cage	Norva Plastics, Norfolk, VA	custom made	Dimensions and layout described in manuscript, can be adjusted according to needs. Use non-reflective plexiglas for to facilitate image processing
Wire cups	Kitchen plus	315	Use one to house stimulus mouse, one empty
Video camera	SONY	HDR-PJ790	Can be replaced by any camera with Comparable specifications
OpenCV (Image processing library)	Willow Garage	N/A	Any modern image processing library can be used.