Avaliação experimental de rato Sociabilidade utilizando uma abordagem de processamento de imagem automatizado

Summary

Este protocolo descreve um método para quantificar a sociabilidade rato. Os ratos são filmadas enquanto se movem e interagem em uma gaiola especial. Processamento de filme permite a quantificação automática de sociabilidade com excelente precisão e confiabilidade.

Abstract

Mouse é o organismo modelo preferido para testar drogas destinadas a aumentar a sociabilidade. Apresenta-se um método para quantificar a sociabilidade rato em que o rato de ensaio é colocado num aparelho normalizado e comportamentos relevantes são avaliadas em três sessões diferentes (chamado sessão I, II, e III).

O aparelho tem três compartimentos (ver Figura 1), os compartimentos da esquerda e da direita contém uma taça invertida, que pode alojar um rato (chamado "rato estímulo").

Na sessão I, o rato de ensaio é colocado na gaiola e a sua mobilidade é caracterizada pelo número de transições entre os compartimentos feitos. Na sessão II, um rato estímulo é colocado sob um dos copos invertidos ea sociabilidade do rato teste é quantificada pelos valores de tempo que passa perto do copo contendo o mouse estímulo fechado contra o copo invertido vazio. Na sessão III, os copos invertidos são removidos de um d ambos os ratos interagir livremente. A sociabilidade do rato teste em sessão III é quantificada pelo número de abordagens sociais que faz em direção ao rato estímulo e pelo número de vezes que ele evita uma abordagem social por parte do rato estímulo.

A avaliação automatizada do filme detecta o nariz do rato de ensaio, o que permite a determinação de todas as medidas de sociabilidade descrito na sessão I e II (na sessão III, abordagens são identificados automaticamente mas classificadas manualmente). Para encontrar o nariz, a imagem de uma gaiola vazia é digitalmente subtraído de cada moldura do filme e a imagem resultante é binarizada para identificar os pixels do rato. A cauda do rato é automaticamente removido e os dois pontos mais distantes do rato restantes são determinados; estes são perto de nariz e base da cauda. Ao analisar o movimento do rato e utilizando os argumentos de continuidade, o nariz é identificado.

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Figura 1. Avaliação da Sociabilidade Durante 3 sessões Sessão I (em cima):.. Aclimatação de rato teste para a gaiola Sessão II (meio):. Teste rato mover-se livremente na gaiola enquanto que o rato estímulo é fechado em um copo invertido Sessão III (parte inferior): Ambos rato teste e rato estímulo estão autorizados a circular livremente e interagir uns com os outros.

Introduction

Sociabilidade prejudicada é um dos domínios principal sintoma em uma variedade de desordens do desenvolvimento neurológico, incluindo transtornos do espectro autista (ASDs) ^1,2. Isso limita severamente a capacidade dos pacientes para desenvolver relacionamentos e afeta muito pacientes, famílias e cuidadores ^2,3.

Num esforço para melhor compreender o mecanismo subjacente a sociabilidade auditivos e desenvolver tratamentos, diversos modelos de ratos têm sido estudados ^1,4-9. Um tal estirpe é o ratinho BALB / c, uma estirpe consanguínea que exibe surpreendentemente baixo sociabilidade, assemelhando-se características observadas em pacientes com ASD5 ^8-12. Por exemplo, o ratinho BALB / c exibe uma menor frequência de abordagens sociais e uma resposta geralmente negativo para abordagens sociais por um rato de estímulo (por exemplo, evitação social) do que a Swiss Webster estirpe comparador ^10.

Para testar se um tratamento proposto é effective no aumento da sociabilidade, são necessárias medidas objetivas. Um quadro é amplamente aceite para analisar a sociabilidade num aparelho normalizado que tem três compartimentos (ver Figura 1).

Os compartimentos esquerda e direita cada conter um copo fio invertido que abriga um rato estímulo socialmente saliente. O rato de teste é lançado para dentro do aparelho durante três intervalos de 10 min (sessões I-III); sessão que avalia a atividade locomotora do rato teste, enquanto as sessões II e III avaliar diferentes aspectos da sociabilidade do rato teste.

Na sessão I, o rato de teste é permitido para se aclimatar ao aparelho. Nesta sessão, o número de transições que o rato de ensaio faz entre os diferentes compartimentos é medido. É importante ressaltar que as medidas de sociabilidade obtido no aparelho de três compartimentos padrão são dependentes de atividade locomotora e atividade locomotora reduzida pode confundir a interpretação de Socidados habilidade.

Na sessão II, o rato teste é movendo-se livremente e um mouse estímulo é colocado sob um dos copos invertidos (contrapeso). Os ratos de estímulo são ratos ICR 4 semanas de idade do sexo masculino não consanguíneos, idade e para os ratinhos de teste pareados por sexo. O estímulo rato é colocado num copo invertido no lado designado como o compartimento social e um copo invertido vazio é colocado no lado designado como o compartimento não social. Na sessão II, a sociabilidade do mouse teste é quantificada por comparação do tempo que passa perto do copo "social" invertido (menos de 2 cm de distância) vs. o tempo que passa perto do copo invertido "não-social", e pelo tempo que gasta no compartimento sociais versus o tempo que gasta no compartimento nonsocial. ratos de comparação Swiss Webster passar muito mais tempo no compartimento social e perto do copo invertido social em comparação aos camundongos BALB / c que mostram nenhuma preferência significativa para o desenvolvimento socialcopo invertido ou do compartimento sociais ^12.

Na sessão III, os ratos de teste e de estímulo estão autorizados a interagir livremente (copos invertidos são removidos). Medidas de sociabilidade, comportamentos estereotipados e transições entre os compartimentos são seguramente obtida na terceira sessão de 10 min de interação livre entre o teste e os ratos de estímulo e analisados. Neste relatório, a sociabilidade do mouse teste é quantificada através de duas medidas: 1) o número de abordagens sociais que faz em direção ao rato estímulo, em que uma abordagem social é definida como avançar (nariz primeiro) para o rato de estímulo para que o nariz é menos de 2 cm de distância do rato estímulo; 2) o número de evitações de abordagens sociais pelo mouse estímulo. O rato teste é considerado estar evitando a abordagem se transforma ou se afasta do rato estímulo, ou se interrompe temporariamente em movimento ( "congelamento comportamento") após o mouse estímulo abordou o mouse teste. BALB /c ratinhos mostram uma diminuição no número de abordagens sociais feitas para o estímulo do rato e um aumento do número de respostas negativas para abordagens sociais por o estímulo rato, em comparação com a estirpe Swiss Webster do comparador ^10.

A avaliação dos filmes de comportamento tem sido tradicionalmente feita manualmente, ou seja, ao assistir o filme com cuidado (possivelmente em velocidade reduzida) e ativando cronómetros para o tempo o mouse passa em um determinado compartimento ou perto de um dos copos invertidos ^10. Este método requer a observação do filme repetidamente e é, portanto, muito demorada. Além disso, a precisão é limitada pelo tempo de reação do avaliador para as medições cronômetro e capacidade de perceber se o mouse está dentro de 2 cm do copo invertido. Em trabalho recente, dois compostos, (D-serina e D-cicloserina) têm se mostrado eficazes no restabelecimento da sociabilidade em camundongos BALB / c ^9,10,12. Sabe-se que ambos os componentes modufinal do receptor de NMDA, que é conhecida por desempenhar um papel fundamental no comportamento social ^2,12. Uma grande variedade de compostos é conhecida por modular a actividade do receptor NMDA numa variedade de formas bem definidas, e o potencial para um grande avanço no tratamento de ASD faz a avaliação acelerada destes compostos uma prioridade e um método automático rápido para avaliação altamente desejável.

Descrito abaixo é um procedimento de análise automática desenvolvido para a avaliação da sociabilidade mouse. Ele usa métodos de processamento de imagem em todos os quadros dos filmes do rato para identificar a posição do mouse ou camundongos. Em sessões I e II, ele detecta ainda mais a posição do nariz e usa-lo para calcular medidas de sociabilidade. Na sessão III, ele detecta automaticamente todas as abordagens, mas é necessária a classificação manual (abordagem social, a evitação social, ou outro).

Protocol

O protocolo para a facilidade de explicação foi dividida em 2 partes: 1) Procedimento experimental e 2) análise automatizado. Todos os animais foram tratados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório 15, e todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional Animal. 1. Procedimento Experimental Defina-se a gaiola, que é um preto não reflectores de Plexiglas quadro rectangular (52 x 25 x 23 cm 3), divi…

Representative Results

A Figura 3 mostra um quadro de cor de um filme de comportamento com uma gaiola vazia. O ratinho não foi introduzido na gaiola ainda. A posição dos copos, e não sociais (sociais) e os limites de compartimento estão sobrepostos. O quadro de cor de gaiola vazia é convertido em escala de cinzentos de 8 bits, como mostrado na Figura 4 e usado como um quadro de referência. O quadro de referência é subtraída de todos os outros quadros do filme capturado. …

Discussion

Ao combinar ratos filmagem e análise de filme automática, criamos uma técnica de triagem acessível, confiável de alto rendimento.

A precisão da análise automatizada foi comparada com os resultados da análise manual para mais de 100 filmes. Na maioria esmagadora dos quadros (> 99%) dos quadros, o nariz do rato é identificado com boa precisão. A maior parte dos (poucos) misdetections não têm nenhum efeito sobre as medidas de sociabilidade, de modo que cerca de 80% dos filmes nã…

Materials

Plexiglas cage	Norva Plastics, Norfolk, VA	custom made	Dimensions and layout described in manuscript, can be adjusted according to needs. Use non-reflective plexiglas for to facilitate image processing
Wire cups	Kitchen plus	315	Use one to house stimulus mouse, one empty
Video camera	SONY	HDR-PJ790	Can be replaced by any camera with Comparable specifications
OpenCV (Image processing library)	Willow Garage	N/A	Any modern image processing library can be used.