Evaluación experimental de ratón sociabilidad Utilizando un enfoque de procesamiento de imágenes automatizado
Summary
Este protocolo describe un método para cuantificar la sociabilidad ratón. Los ratones se graban en vídeo mientras se mueven e interactúan en una jaula especial. Procesamiento de vídeo permite la cuantificación automatizada de la sociabilidad con una excelente precisión y fiabilidad.
Abstract
Mouse es el organismo modelo preferido para probar fármacos diseñados para aumentar la sociabilidad. Se presenta un método para cuantificar la sociabilidad ratón en el que se coloca el ratón análisis en un aparato estandarizado y comportamientos relevantes se evaluó en tres sesiones diferentes (llamado sesión I, II y III).
El aparato tiene tres compartimentos (ver Figura 1), los compartimientos izquierdo y derecho contener una copa invertida que puede alojar un ratón (llamado "estímulo de ratón").
En la sesión I, el ratón de prueba se coloca en la jaula y su movilidad se caracteriza por el número de transiciones realizadas entre compartimentos. En la sesión II, un estímulo del ratón se coloca debajo de una de las tazas invertidas y la sociabilidad de la prueba ratón se cuantifica por las cantidades de tiempo que pasa cerca de la copa que contiene el ratón estímulo cerrado frente a la copa invertida vacía. En la sesión III, las tazas invertidas se eliminan una d tanto en ratones interactúan libremente. La sociabilidad del ratón de ensayo en sesión III se cuantifica por el número de enfoques sociales que hace hacia el estímulo del ratón y por el número de veces que se evita un enfoque social por el ratón estímulo.
La evaluación automatizada de la película detecta la nariz del ratón de prueba, que permite la determinación de todas las medidas de sociabilidad que se describen en la sesión I y II (en la sesión III, los enfoques son identificados automáticamente, pero clasifican manualmente). Para encontrar la nariz, la imagen de una jaula vacía se sustrae digitalmente de cada fotograma de la película y la imagen resultante se digitalizan para identificar los píxeles del ratón. La cola del ratón se elimina automáticamente y los dos puntos más distantes del ratón restante se determinan; estos están cerca de la nariz y la base de la cola. Mediante el análisis del movimiento del ratón y el uso de argumentos de continuidad, se identifica la nariz.
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Figura 1. Evaluación de la sociabilidad Durante 3 sesiones Sesión I (parte superior):.. La aclimatación de prueba ratón a la jaula Sesión II (medio):. Prueba de ratón el moverse libremente en la jaula mientras que el estímulo del ratón está encerrado en una copa invertida Sesión III (parte inferior): Tanto la prueba ratón y el ratón de estímulo se les permite moverse libremente e interactuar unos con otros.
Introduction
Sociabilidad alterada es uno de los dominios de los síntomas primarios en una variedad de trastornos del desarrollo neurológico, incluyendo los trastornos del espectro autista (TEA) 1,2. Se limita severamente la capacidad de los pacientes para desarrollar relaciones y afecta en gran medida los pacientes, familias y cuidadores 2,3.
En un esfuerzo para entender mejor el mecanismo subyacente de la sociabilidad deteriorado y desarrollar tratamientos, varios modelos de ratón han sido estudiados 1,4-9. Uno de estos es la cepa de ratón BALB / c, una cepa endogámica que exhibe sorprendentemente baja sociabilidad, que se asemeja características que se observan en pacientes con ASD5 8-12. Por ejemplo, el ratón BALB / c muestra una menor frecuencia de enfoques sociales y una respuesta generalmente negativa a los enfoques sociales por un ratón estímulo (por ejemplo, evitación social) que la cepa comparador Swiss Webster 10.
Para probar si un tratamiento propuesto es effective en el aumento de la sociabilidad, se necesitan medidas objetivas. Un marco ampliamente aceptado es analizar la sociabilidad en un aparato estandarizado que tiene tres compartimentos (ver Figura 1).
Los compartimientos izquierdo y derecho contienen cada uno una copa invertida de alambre que alberga un ratón estímulos socialmente relevante. El ratón de prueba se libera en el aparato para tres intervalos de 10 min (sesiones I-III); sesión de I evalúa la actividad locomotora del ratón de prueba, mientras que las sesiones II y III evaluar diferentes aspectos de la sociabilidad de la prueba ratón.
En la sesión I, se permite que el ratón de prueba para aclimatar al aparato. En esta sesión, se mide el número de transiciones que la prueba ratón hace entre los diferentes compartimentos. Es importante destacar que las medidas de sociabilidad obtenidos en el aparato de tres compartimientos estándar dependen de la actividad locomotora y la actividad locomotora reducida pueden confundir la interpretación de socilos datos de capacidad.
En la sesión II, la prueba ratón se mueve libremente y un estímulo del ratón se coloca debajo de una de las tazas invertidas (compensada). Los ratones de estímulo son viejos ratones ICR macho no consanguíneos de 4 semanas, por edad y sexo adaptado a los ratones de prueba. El ratón estímulo está encerrado en una copa invertida en el lado designado como el compartimiento social y una copa invertida vacía se coloca en el lado designado como el compartimiento no social. En la sesión II, la sociabilidad de la prueba ratón se cuantifica mediante la comparación del tiempo que pasa cerca de la copa "social" invertida (menos de 2 cm de distancia) versus el tiempo que pasa cerca de la copa invertida "no social", y por el momento que pasa en el compartimento sociales versus el tiempo que pasa en el compartimento no social. ratones Swiss Webster comparadores pasan mucho más tiempo en el compartimiento social y cerca de la copa invertida social, en comparación con los ratones BALB / c que no muestran ninguna preferencia significativa para el desarrollo socialcopa invertida o el compartimento sociales 12.
En la sesión III, los ratones de prueba y de estímulo se les permite interactuar libremente (tazas invertidas se eliminan). Las medidas de sociabilidad, comportamientos estereotipados y las transiciones entre los compartimentos se obtienen de forma fiable en la tercera sesión de 10 minutos de interacción libre entre los ratones de prueba y de estímulo y analizado. En este informe, la sociabilidad de la prueba ratón se cuantifica a través de dos medidas: 1) el número de enfoques sociales que tiene hacia el estímulo del ratón, donde un enfoque social se define como el movimiento hacia adelante (empezando por la nariz) hacia el estímulo del ratón de modo que la nariz es inferior a 2 cm de distancia del ratón de estímulo; 2) el número de evitaciones de enfoques sociales por el ratón estímulo. El ratón prueba se considera estar evitando el enfoque si resulta o se aleja del estímulo del ratón, o si se detiene temporalmente en movimiento ( "comportamiento congelación") después de que el estímulo del ratón se ha acercado a la prueba ratón. BALB /ratones c muestran una disminución en el número de enfoques sociales realizados para el ratón estímulo y un aumento en el número de respuestas negativas a enfoques sociales por el ratón de estímulo, en comparación con la cepa comparador Swiss Webster 10.
La evaluación de las películas de comportamiento se ha hecho tradicionalmente de forma manual, es decir, por ver la película cuidadosamente (posiblemente a velocidad reducida) y la activación de los contadores de tiempo para el tiempo que el ratón pasa en un determinado compartimiento o cerca de una de las tazas invertidas 10. Este método requiere observación de la película en varias ocasiones y es, por lo tanto, mucho tiempo. Además, la exactitud está limitada por el tiempo de reacción del evaluador para las mediciones de cronómetro y su capacidad de percibir si el ratón está dentro de 2 cm de la copa invertida. En un trabajo reciente, dos compuestos, (D-serina y D-cicloserina) han demostrado ser eficaces en la restauración de la sociabilidad en ratones BALB / c 9,10,12. Se sabe que tanto los componentes modufinales del receptor NMDA, que se sabe que juega un papel central en el comportamiento social 2,12. Un gran conjunto de compuestos es conocida para modular la actividad del receptor NMDA en una variedad de formas bien definidas, y la posibilidad de un gran avance en el tratamiento ASD hace que la evaluación acelerada de estos compuestos en una prioridad y un método rápido y automático para la evaluación altamente deseable.
A continuación se describe un procedimiento de análisis automático desarrollado para la evaluación de la sociabilidad ratón. Utiliza métodos de procesamiento de imágenes en todas las tramas de las películas de ratón para identificar la posición del ratón o ratones. En las sesiones I y II, se detecta aún más la posición de la nariz y la utiliza para calcular las medidas de sociabilidad. En la sesión III, que detecta automáticamente todos los enfoques, pero se requiere la clasificación manual (enfoque social, evitación social, o de otro tipo).
Protocol
Representative Results
Discussion
Mediante la combinación de los ratones grabar en vídeo y análisis automático de la película, hemos creado una técnica asequible y fiable de alto rendimiento de cribado.
La precisión del análisis automatizado se comparó con los resultados del análisis manual para más de 100 películas. En la inmensa mayoría de los marcos (> 99%) de los marcos, la nariz del ratón se identifica con una buena precisión. La mayor parte de los (pocos) misdetections tienen ningún efecto sobre las …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por subvenciones del Consejo de Investigación de la Salud de la Commonwealth de Virginia.
Materials
| Plexiglas cage | Norva Plastics, Norfolk, VA | custom made | Dimensions and layout described in manuscript, can be adjusted according to needs. Use non-reflective plexiglas for to facilitate image processing |
| Wire cups | Kitchen plus | 315 | Use one to house stimulus mouse, one empty |
| Video camera | SONY | HDR-PJ790 | Can be replaced by any camera with Comparable specifications |
| OpenCV (Image processing library) | Willow Garage | N/A | Any modern image processing library can be used. |
Riferimenti
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