Bestämma membranprotein Topologi Använda Fluorescens Proteas Protection (FPP)

Summary

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

Abstract

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Introduction

De plasmamembran, liksom de många intracellulära membran, tjänar som hinder som skiljer två vattenhaltiga kamrar. I fallet med plasmamembranet, är separationen mellan utsidan och insidan av cellen; för intracellulära organeller är det mellan cytoplasman och organell lumen. Till exempel, separerar det endoplasmatiska retiklet (ER) membranet en oxiderande miljö inom lumen av ER från ett cytosoliskt reducerande miljö ^1. Membranproteiner syntetiseras på ER-associerade ribosomer, och uppnå sin slutliga topologi inom ER-membranet ^2. Förvärvet av lämpliga membran orientering och topologi för proteiner är avgörande för deras normala funktion. Korrekt topologi tillåter relevanta domäner av membranproteiner för att interagera med deras bindningspartners, tillåter den kritiska post-translationella modifieringar för att uppträda, och i fallet av plasmamembranproteiner, tillåter cellen att interagera med och svara to dess miljö. För att till fullo uppskatta funktionen av ett membranprotein, är det helt klart nödvändigt att veta hur detta protein är orienterade i förhållande till membranet inom där den finns, dvs dess membran topologi. Förutom förvärvet av grundläggande vetenskaplig kunskap, förståelse topologin av en membranprotein och vilka aspekter av ett protein yta utsätts för olika miljöer har markerat kliniska implikationer eftersom membranproteiner utgör merparten av farmakologiska mål ^3. Tills nyligen, metoder för att bestämma membranprotein topologi har krävt betydande investeringar i tid och pengar, eller krävt reagens som är svåra att få tag på.

Både experimentella och i silico metoder har använts för att bestämma membrantopologin av proteiner som är bosatta inom plasmamembranet. Eftersom de första förutsägelser av membranöverbryggande domäner baserat på den utvärderade hydrofobicitet av indidubbla aminosyror ^3, många prediktiva algoritmer finns nu tillgängliga på internet, och helt enkelt kräver kunskap om proteinets aminosyrasekvens. Men antaganden är ofta centralt för sådana modelleringsprogram, antaganden som kan leda till felaktiga uppdrag av topologi ^4,5. Dessutom, även om dessa datorbaserade förutsägelser kan försöksvis tilldela membranomspännande regionerna, de inte alltid avgöra om amino- eller karboxitermini av proteiner är i cytoplasman, organell lumen eller cell exteriör. Även med ökad datorkraft, och användningen av maskininlärningsalgoritmer ^6, sådana uppgifter är fortfarande en modell, och måste valideras med hjälp experimentellt förvärvade data. Direkt experimentell bestämning av membran topologi har genomförts med hjälp av paneler av monoklonala antikroppar med kända epitoper fördelade över hela proteinet, där bedömning av deras immunreaktivitet har gjorts före och efter cell permeabilization. Dettatillvägagångssätt kräver en uppsättning av antikroppar, som kanske inte är tillgängliga för proteinet av intresse.

En alternativ strategi är att ingenjör epitopmärkningar sådana som myc eller hemagglutinin (HA) i olika platser i hela proteinet, återigen följt av bestämning av immunreaktivitet före och efter membran permeabilization. Förutom immunogena taggar, har enzymatiska taggar (inklusive alkaliskt fosfatas, β-galaktosidas, eller β-laktamas) och kemiska modifieringar såsom cystein skanning alla använts för att bestämma membranprotein topologi ^7,8. En ytterligare metod som används för topologisk kartläggning av plasmamembranproteiner bygger på ett något annorlunda sätt att epitopmärkningar. I denna metod markörsekvensen är den N-kopplad glykosylering konsensussekvensen NXS / T. Eftersom glykosylering sker endast när en sådan sekvens är närvarande i lumen i den biosyntetiska vägen, närvaron av etiketten i en luminal kontraett cytosoliskt utrymmet är lätt observeras som en massförskjutning på SDS-PAGE-geler. Ett sådant tillvägagångssätt har tillämpats på multispanning jonkanal CFTR ^9. Medan alla dessa angreppssätt har använts, är det tydligt att de alla kräver betydande investeringar i molekylärbiologi för att generera och sekvens de många konstruktioner.

För att bestämma topologisk information om transmembranproteiner som ligger inom intracellulära organeller har visat sig vara mer utmanande. Tillämpningen av fluorescensbaserade tekniker har dock gjort bestämning av membran topologi mycket enklare. Tekniken med bimolekylära fluorescens komplettering (BiFC) bygger på samspelet mellan två icke-fluorescerande fragment av ett fluorescerande protein, återställa de fluorescerande egenskaper som protein ^10. Även initialt beskrivits för bestämning av protein-proteininteraktioner in vivo ^10, har denna metod också utnyttjatsatt bestämma membranprotein topologi i växtceller ^11. Men detta synsätt är också tidskrävande eftersom det kräver generering av inte bara fusionsproteiner med proteinet av intresse, men också en mängd olika fusionsproteiner riktade till cytosolen eller organell lumen, och kräver kunskap om vilka intracellulära membran proteinet av intresse är bosatt i .

Ett alternativt enklare metod för att fastställa membranprotein topologi har beskrivits ^12. Analysen, Fluorescence Proteas Protection (FPP) kräver generering av ett fusionsprotein mellan GFP och genen av intresse. Systemet är baserat på den relativa tillgängligheten av icke-specifika proteaser till GFP-del; beroende på om GFP är skyddad från proteolys genom bosatt i lumen av intracellulära organeller eller är utsatt för proteolys genom att vara närvarande i cytosolen. Således, om GFP-delen på proteinet av intresse är vänd mot cytoplasman, den kommer att utsättas förproteasaktivitet och fluorescenssignalen förloras. Omvänt, om GFP-delen på proteinet av intresse är vänd mot en miljö "skyddade" från proteaset (såsom Golgi lumen) sedan fluorescenssignalen kommer att bestå.

Att tillåta proteaser för att komma in i cellen, men inte gå in intracellulära membran fack kolesterol bindande drog digitonin används. Kolesterol är den dominerande sterol i vertebrater, och är specifikt berikad på plasmamembranet relativt intracellulära avdelningar. Den glykosid toxin, digitonin, utvinns ur växten Digitalis purpurea. Digitonin har en affinitet för kolesterol rika membran, där det leder till selektiv membran permeabiliztion ^14,16 (Figur 1). Förutom att tillåta utförsel av små cytosoliska komponenter, digitonin permeabilization tillåter också införandet av exogena molekyler, såsom proteinas K eller trypsin. FPP-protokollet drar fördel av fact att plasmamembranet innehåller upp till 80% av cellulär kolesterol ^17, medan andra organeller, såsom ER, Golgi, endosomer, mitokondrier, som har mycket låg kolesterolhalt, förblir intakta ^14. Den selektiva inkorporeringen av kolesterol in i plasmamembranet har observerats i många eukaryota celler, vilket medger användningen av digitonin-beroende plasmamembranet permeabilisering i så skilda eukaryota arter som S. cerevisiae människors ^14,18. FPP-analysen ger en enkel, snabb och ganska robusta sätt att bestämma (a) huruvida ett protein är membranbundna / associerade eller fritt diffunderbart i cytosolen och (b) vilken domän av en membranprotein ansikten cytosolen eller organell lumen. Skulle ett membranprotein har flera inriktningar, kommer signalen uppstå från den dominerande formen och mindre former kommer inte att upptäckas. Samtidigt som det kan finnas viss oro att tillsatsen av en GFP-del till proteinet på intresse kan påverka dess funktion och/ Eller subcellulära lokalisering, detta är faktiskt mer teoretisk än verklig. Faktiskt många studier har tydligt visat att GFP taggen inte ändrar egenskaperna hos proteinet ^19,20.

Protocol

1. Generation och validering av fluorescerande protein chimärer Append grönt fluorescerande protein (GFP) till amino- eller karboxylterminalerna av proteinet av intresse med användning av vanliga rekombinant-DNA-strategier 13. OBS: Även om vi har använt GFP i stor utsträckning, andra varianter såsom cyan fluorescerande protein (GFP), gulfluorescerande protein (YFP), DsRed och mCherry kan användas. Förbättringar i fluorofor fällbara effektivitet, ljusstyrka och foto ständigt görs…

Representative Results

Plasma Membrane Permeabilization Effektiv plasmamembranet permeabilisering bestäms av användningen av lösliga fluorescerande proteiner (t.ex. GFP, DsRed) (steg 4). Dessa proteiner, uttryckt i celler, är fria att diffundera i cytosolen, och försvinner när plasmamembranet permeabilized använder digitonin (Figur 2). En fullständigt försvinnande av fluorescerande signal bör ske inom 10-60 sekunder av digitonin ansökan. Bekräftelse på att proteinet …

Discussion

Korrekt orientering och topologi av membranproteiner är avgörande för deras rätta funktion. Trots vikten av att förstå membranprotein topologi, det finns många proteiner för vilka sådana uppgifter saknas helt. FPP ger ett enkelt och effektivt sätt att bestämma membranprotein topologi, och en som kan utföras av de flesta laboratorier. FPP tillvägagångssätt ger betydande fördelar jämfört med tidigare metoder för att bestämma protein topologi. Till exempel finns det ingen anledning att ha en panel av mu…

Materials

Name	Company	Catalgue Number	Comments
Digitonin	Calbiochem	300410
Proteinase K	Sigma	P2308
Trypsin	Sigma	T3924
Cav1-GFP	Addgene	44433
pAcGFP-1 Golgi	Clontech	632464
Polylysine	Sigma	P4707
Mounting Media	Dako	cS704