이미징 로컬 CA<sup> 2 +</sup> 배양 된 포유 동물 세포에서 신호
Summary
Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.
Abstract
세포질 칼슘 2 + 이온은 유전자 전사, 전기 흥분과 세포 증식으로 광범위한 프로세스를 제어, 거의 모든 종류의 세포에서 세포 활동의 다양한 측면을 조절한다. 칼슘 신호의 다양성과 특이성은 현지 과도 칼슘 마이크로 도메인 분의 기간에 걸쳐 발생하는 세포 전체의 진동과 파도에 이르기까지 칼슘 신호는 서로 다른 시간과 공간 규모 이상 행동을 생성하는 메커니즘에서 유래 (칼슘 퍼프) 지속 (밀리 초). 전자의 최근 진보는 CCD는 (EMCCD) 카메라는 지금> 500 프레임 초 -1 (FPS)의 속도로 128 X 128 픽셀의 공간 해상도를 가진 지역의 칼슘 신호의 영상을 허용 곱한. 이 접근법은 매우 평행 한 번의 실험에서 채널 또는 퍼프 사이트 수백 동시에 모니터링 할 수있다. 그러나, 데이터의 방대한 양의 생성 (약 1 기가 체육R 최소) 2 + 이벤트 불가능한 로컬 CA의 시각적 식별 및 분석을 렌더링합니다. 여기에 우리가 설명하고 수집, 탐지를위한 절차를 설명하고, 넓은 필드 에피 형광 (WF) 및 총 내부 반사를 모두 사용하여 칼슘 2 + 지표로드 그대로 포유류 세포에서 칼슘에게 2+ 신호를 매개 성 3 로컬 IP 분석 형광 (TIRF) 현미경. 또한, 우리는이 지역의 칼슘 신호의 식별 및 분석을 자동화 오픈 소스 소프트웨어 환경 파이썬에서 개발 한 알고리즘을 설명합니다. 알고리즘은 서브 픽셀 해상도의 칼슘 방출 사이트 편재; 데이터의 사용자 리뷰를 할 수 있습니다; 엑셀과 호환 표의 진폭 및 속도 데이타와 함께 형광 신호의 비율의 시간 시퀀스들을 출력한다.
Introduction
칼슘 이온 (칼슘)는 도처 유전자 발현, 분비 및 시냅스 가소성 1 오래 지속 변경 사항을 포함 생물학적 과정의 다양한 범위를 조절한다. 칼슘은 다양한 방식으로 행동 할 수있는 방법 중 하나는 칼슘의 다른 공간과 시간 패턴을 통해 세포가 생성 할 수있는 신호를 보낸다. 세포질에서 예를 글로벌 고도 부드러운 근육 조직이 작은 반면에 [칼슘] 트리거 수축, 지역화 된 과도 고도 (현지 칼슘 마이크로 도메인)은 학습과 기억 (3)에 필수적인 유전자 발현을 자극한다.
무료 세포질은 [칼슘 2 +] ~ 100 nm의 휴식에 유지되지만 빠르게 칼슘 통해 세포질로 칼슘의 유입 다음과 같은 몇 가지 마이크로 몰로 세포막에 의해 위치 2+ -permeable 이온 채널을 상승 할 수있다 세포 내에서의 칼슘의 해방tores. 우리 연구소는 소포체 (ER) 막에있는 칼슘 릴리스 채널을 형성하는 이노시톨 1,4,5-trisphosphate 수용체 (IP 3 R)에 초점을 맞추고있다. 수용체의 사이트를 활성화 세포질에 모두 IP (3)과 칼슘의 결합하면, IP (3) R 채널은 칼슘이 ER 루멘 내에서 압수 해방 열립니다. 칼슘 이온의 방출이 공간적으로 (칼슘 2 + 퍼프 4) 칼슘 2의 로컬 세포질 마이크로 도메인을 생성하는 IP 3 루피의 작은 클러스터로 제한 상태로 유지하거나, IP 3 루피의 이웃 클러스터의 근접 정도에 따라 할 수있다 칼슘 유도 된 칼슘 -release (CICR) 5,6의 과정을 통해 여러 퍼프 사이트를 모집하여 세포 전체에 전파.
고급 현미경 imagi과 함께 첸 7 로저에 의해 개발 된 형광 작은 분자 칼슘 지표 염료의 도입,기술을 ng를, 칼슘 신호에 대한 우리의 이해를 촉진 크게있다. 현미경에 사용되는 카메라의 최근 진보는 지금과 같은 전례없는 공간과 시간 해상도 퍼프로 과도 지역 칼슘 이벤트를 이미징 할 수 있습니다. 현재 EMCCD 카메라> 500 프레임 초 -1 (FPS) 및 상보 형 금속 산화 반도체의 새로운 세대에서 128 X 128 픽셀 이미징 할 (CMOS) 카메라가 약간 높게의 비용보다 높은 화소 해상도 및 더 빠른 속도를 제공 할 소음 수준. 총 내부 반사 (TIRF) 현미경과 함께 그것은 이미지에 이제 하나의 칼슘 채널 이벤트 8,9 가능하다. 실무적 수동 처리, 시각적 식별 및 분석 렌더링 자동화 알고리즘 개발에 부담을 배치 대용량 데이터 세트 (분당을 약 1 기가 바이트)를 생성하는 동안이 방법은, 동시에 채널 / 이벤트 수백 이미징을 허용한다.
<p class = "jove_content"> 여기, 우리가 형광 칼슘 2 + 지표를 사용하여 그대로 포유류 세포에서 지방의 칼슘 신호를 영상화하기위한 절차 및 프로토콜을 제시한다. 우리는 더 TIRF 기존 넓은 필드 에피 형광 (WF) 현미경 모두 몇 군데 지역 칼슘 이벤트의 식별 및 분석을 자동화 오픈 소스 환경 파이썬으로 개발 한 알고리즘을 보여줍니다. 우리는 IP 칼슘 신호를 -generated 3의 맥락에서 이러한 방법을 설명하지만, 그들은 [칼슘 2 +] 칼슘의 다양한 중 표면에있는 2 + -permeable 이온 채널을 발산 세포질에서 로컬 변경 사항을 연구하기 쉽게 의무가 있습니다 막 또는 세포 내 소기관 8-10.Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 여기에 설명 형광 칼슘 2 + 지표를 사용하여 배양 된 포유 동물 세포에서 지방의 칼슘 이벤트를 이미징 프로토콜. 또한, 우리는 식별 및 수집 된 데이터의 분석을 자동화하는 직관적 인 사용자 인터페이스와 알고리즘을 설명합니다. 여기에 설명 된 절차는 형광 칼슘 지표 칼-520을 이용하지만, 그러한 FLUO-3, FLUO-4, FLUO-8 및 오레곤 그린 BAPTA-1 등 다른 많은 칼슘…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health grants GM 100201 to I.F.S, and GM 048071 and GM 065830 to I.P.
Materials
| Name | Company | Catalogue No. |
| Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells | ATCC | CRL-2266 |
| Cal-520/AM | AAT Bioquest Inc. | 21130 |
| ci-IP3 (D-23-O-Isopropylidene-6-O-(2-nitro-4.5-dimethoxy)benzyl-myo-Inositol 145-trisphosphate-Hexakis(propionoxymethyl) | SiChem | cag-iso-2-145-10 |
| DMSO/20% pluronic F127 | Invitrogen | P-3000MP |
| EGTA/AM | Invitrogen | E-1219 |
| 35 mm glass-bottom imaging dishes | MatTek | P35-1.5-14-C |
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