Imaging Lokal Ca²⁺ Signaler i dyrkede pattedyrceller

Summary

Here we present techniques for imaging local IP₃-mediated Ca²⁺ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca²⁺ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Abstract

Cytosolisk Ca ^{2 +} ioner regulerer mange aspekter av cellulær aktivitet i nesten alle celletyper, kontrollerende prosesser som vidtrekk som gentranskripsjon, elektrisk oppstemthet og celledeling. Mangfoldet og spesifisitet av Ca ²⁺ signale stammer fra mekanismer som Ca ^{2 +} signaler genereres til å handle over ulike tids og romlige skalaer, fra celle-wide svingninger og bølger som oppstår i løpet av de perioder av minutter til lokale forbigående Ca ^{2 +} mikroområder (Ca ²⁺ puffs) varige millisekunder. Nylige fremskritt i elektron multiplisert CCD (EMCCD) kameraer nå tillate for avbildning av lokale Ca ²⁺ signaler med en 128 x 128 pikslers romlig oppløsning ved hastigheter på> 500 rammer sek ^-1 (fps). Denne fremgangsmåten er svært parallelle og muliggjør samtidig overvåkning av flere hundre kanaler eller puff områder i et enkelt eksperiment. Men de enorme mengder data som genereres (ca 1 Gb per min) gjengi visuell identifisering og analyse av lokale Ca ²⁺ hendelser upraktisk. Her beskriver vi og demonstrere prosedyrene for erverv, deteksjon og analyse av lokal IP _3-formidlet Ca ^{2 +} signaler i intakte pattedyrceller lastet med Ca ²⁺ indikatorer som bruker både vidvinkel epi-fluorescens (WF) og total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi. Videre beskriver vi en algoritme utviklet innen åpen kildekode miljøet Python som automatiserer identifisering og analyse av disse lokale Ca ²⁺ signaler. Algoritmen lokaliserer områder av Ca ²⁺ utgivelsen med sub-piksler; lar brukeren gjennomgang av data; og utganger tids sekvenser av fluorescens ratio signaler sammen med amplitude og kinetiske data i et Excel-kompatibelt tabellen.

Introduction

Kalsiumioner (Ca ²⁺⁾ ubiquitously regulere et mangfoldig utvalg av biologiske prosesser, herunder genuttrykk, sekresjon og varige endringer i synaptisk plastisitet ^en. En måte gjennom hvilke Ca ²⁺ kan opptre på en slik mangfoldig måte er gjennom de ulike romlige og tidsmessige mønstre av Ca ²⁺ signaliserer en celle kan generere. For eksempel globale økninger i cytosolisk [Ca ^2+] trigger sammentrekning i glatt muskelvev ^a mens mindre, lokale Forbigående økning (lokale Ca ²⁺ mikroområder) stimulere genuttrykk viktig for læring og hukommelse ^tre.

Cytosolisk fri [Ca2 ^+] holdes ved ~ 100 nM ved hvile, men kan raskt stige til flere mikro molar etter tilførsel av Ca2 ⁺ inn i cytosol gjennom Ca ²⁺ -permeable ionekanaler lokalisert i plasmamembranen og etter frigjøringen av Ca ²⁺ fra intracellulære sTores. Laboratoriet fokuserer på inositol 1,4,5-trisphosphate reseptor (IP ₃ R), som danner en Ca2 ⁺ frigivelse kanal plassert i det endoplasmatiske retikulum (ER) membran. Ved binding av både IP ₃ og Ca ²⁺ til cytosoliske aktiverende områder av reseptoren, åpnes IP ₃ R-kanal for å frigjøre Ca ²⁺ sekvestrert innenfor ER lumen. Utgivelsen av Ca ²⁺ kan forbli romlig begrenset til en liten klynge av IP ₃ R for å generere en lokal cytosolisk microdomain av Ca ²⁺ (Ca ²⁺ puff ⁴⁾ eller, avhengig av nærhet til nabo klynger av IP ₃ R, kan forplante gjennom en celle ved å rekruttere flere puffsider gjennom en prosess med Ca ²⁺ -indusert Ca ²⁺ -release (CICR) ^5,6.

Innføringen av fluorescerende lite molekyl Ca ²⁺ indikatorfarger utviklet av Roger Tsien ^7, kombinert med avansert mikros Imaging teknikker, har i stor grad vår forståelse av Ca ²⁺ signalering. Nylige fremskritt i kameraene som brukes for mikros nå tillate for avbildning forbigående lokale Ca ²⁺ arrangementer som puffs med enestående romlig og tidsmessig oppløsning. For tiden tilgjengelige EMCCD kameraer aktiver bildebehandling med 128 x 128 piksler på> 500 rammer sek ^-1 (fps) og den nye generasjonen av Complementary Metal Oxide Semiconductor (CMOS) kameraer gir høyere pikseloppløsning, og enda raskere hastighet på bekostning av noe høyere støynivå. I forbindelse med total intern refleksjon (TIRF) mikroskopi er det nå mulig å avbilde enkelt Ca ²⁺ kanal hendelser ^8,9. Denne tilnærmingen gjør det mulig for avbildning av hundrevis av kanaler / hendelser samtidig, mens generere store datasett (ca. 1 Gb per min) som gjør manuell behandling, visuell identifisering og analyse upraktisk og plassere en tyngende på utvikling av automatiserte algoritmer.

<p class = "jove_content"> Her presenterer vi prosedyrer og protokoller for bildebehandling lokale Ca ²⁺ signaler i intakte pattedyrceller ved hjelp av fluorescerende Ca ^{2 +} indikatorer. Vi ytterligere demonstrere en algoritme utviklet i åpen kildekode-miljøet Python som automatiserer identifisering og analyse av lokale Ca ²⁺ hendelser fotografert av både TIRF og konvensjonell bredt felt epi-fluorescens (WF) mikroskopi. Selv om vi beskrive disse tilnærminger i sammenheng med IP ₃ dannede Ca ²⁺ signaler, de er lett mottagelig for å studere lokale endringer i cytosol [Ca2 ^+] som utgår fra en rekke Ca ²⁺ -permeable ionekanaler lokalisert i enten overflaten membran eller intracellulære organeller ^8-10.

Protocol

Vi presenterer detaljerte prosedyrer for bildebehandling lokale Ca 2+ hendelser i menneskelig neuroblastom SH-SY5Y celler. Disse fremgangsmåtene kan tilpasses bilde intracellulær Ca2 + signaler i mange celletyper 8-10. 1. Fremstilling av cellene Kultur cellene som skal avbildes i henhold til instruksjonene oppført på deres leverandør hjemmeside. Et par dager før bildebehandling, slakte celler dyrket i et vevskulturkolbe bruker 1 ml …

Representative Results

Figur 1a viser en WF bilde av hvile Cal-520 fluorescens i menneskelige neuroblastom SH-SY5Y celler også lastet med ci-IP 3. Eksponering av disse cellene til en 100 msek UV flash til foto-release i-IP 3 fremkalte forbigående Ca 2 + puff ved diskrete områder (fremgår av de hvite sirklene i figur 1A). Fluorescens spor, målt på disse stedene viste en hurtig stigende fase på grunn av forbigående åpninger av IP 3 R, etterfulgt av en mye lan…

Discussion

Vi beskriver her protokoller for avbildning lokale Ca ²⁺ hendelser i dyrkede pattedyrceller ved hjelp av fluorescerende Ca ^{2 +} indikatorer. Videre beskriver vi en algoritme med et intuitivt brukergrensesnitt som automatiserer identifisering og analyse av innsamlede data. Fremgangsmåten beskrevet her utnytte den fluorescerende Ca ²⁺ indikator Cal-520, men mange andre Ca ²⁺ følsomme fargestoffer som Fluo-3, Fluo-4, Fluo-8 og Oregon Grønn BAPTA-1 utføre tilstrekkelig godt til…

Materials

Name	Company	Catalogue No.
Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells	ATCC	CRL-2266
Cal-520/AM	AAT Bioquest Inc.	21130
ci-IP3 (D-23-O-Isopropylidene-6-O-(2-nitro-4.5-dimethoxy)benzyl-myo-Inositol 145-trisphosphate-Hexakis(propionoxymethyl)	SiChem	cag-iso-2-145-10
DMSO/20% pluronic F127	Invitrogen	P-3000MP
EGTA/AM	Invitrogen	E-1219
35 mm glass-bottom imaging dishes	MatTek	P35-1.5-14-C