Imaging Lokala Ca²⁺ Signaler i odlade däggdjursceller

Summary

Here we present techniques for imaging local IP₃-mediated Ca²⁺ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca²⁺ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Abstract

Cytosoliskt Ca2 ⁺ joner reglerar många aspekter av cellulär aktivitet i nästan alla celltyper, styrning av processer som omfattande som gentranskription, elektriska retbarhet och celltillväxt. Mångfalden och specificitet av Ca2 ⁺ signalering härrör från mekanismer genom vilka Ca2 ⁺ signaler genereras verka på olika tids och rumsliga skalor, från cellomfattande svängningar och vågor som inträffar under perioder av några minuter till lokala gående Ca2 ⁺ mikro (Ca2 ⁺ puffar) varaktiga millisekunder. Senaste framstegen inom elektron multiplicerat CCD (EMCCD) kameror tillåter nu för avbildning av lokala Ca2 ⁺ signaler med 128 x 128 pixel rumslig upplösning vid hastigheter av> 500 bildrutor sek ^-1 (fps). Detta tillvägagångssätt är mycket parallellt och möjliggör samtidig övervakning av hundratals kanaler eller puff platser i ett enda experiment. Emellertid de enorma mängder data som genereras (ca 1 GB per min) gör visuell identifiering och analys av den lokala Ca ^{2 +} evenemang ogenomförbart. Här beskriver vi och demonstrera förfarandena för förvärvet, detektion och analys av lokala IP ₃ medierad Ca ^{2 +} signaler i intakta däggdjursceller laddade med ^{Ca2 +} indikatorer som använder både brett fält epi-fluorescens (WF) och total inre reflektion fluorescens (TIRF) mikroskopi. Dessutom beskriver vi en algoritm som utvecklats inom öppen källkod miljö Python som automatiserar identifiering och analys av dessa lokala Ca ^{2 +} signaler. Algoritmen lokaliserar platser i Ca2 ⁺ release med sub-pixel upplösning; tillåter användaren översyn av data; och matar tidssekvenser av fluorescens förhållandesignaler tillsammans med amplitud och kinetiska data i en Excel-kompatibla bord.

Introduction

Kalciumjoner (Ca2 ⁺⁾ ubiquitously reglerar ett varierat utbud av biologiska processer, inklusive genuttryck, sekretion och varaktiga förändringar i synaptisk plasticitet ^1. Ett sätt genom vilket Ca2 ⁺ kan agera på ett sådant mångsidigt sätt är genom de olika rumsliga och tidsmässiga mönster av Ca2 ⁺ signalerar en cell kan generera. Till exempel globala förhöjningar av cytosoliskt [Ca2 ^+] trigger kontraktion i glatt muskelvävnad ² medan mindre, lokala gående förhöjningar (lokala Ca2 ⁺ mikro) stimulera genuttryck viktigt för inlärning och minne ^3.

Fri cytosolisk [Ca2 ^+] hålles vid ~ 100 nm vid vila, men kan snabbt stiga till flera mikro-molar efter inflödet av Ca2 ⁺ i cytosolen genom Ca2 ⁺ -permeable jonkanaler lokaliserade i plasmamembranet och genom befrielsen av Ca2 ⁺ från intracellulära sTores. Vårt laboratorium fokuserar på inositol 1,4,5-trifosfat-receptorn (IP ₃ R), som bildar en Ca ²⁺ frisättning kanal som finns i det endoplasmatiska retiklet (ER) membranet. Vid bindning av både IP ₃ och Ca2 ⁺ till cytosoliska aktiverande ställen av receptorn, öppnar IP ₃ R-kanal för att befria Ca2 ⁺ binds inom ER lumen. Frisläppandet av Ca2 ⁺ kan förbli spatialt begränsad till ett litet kluster av IP ₃ Rs att generera en lokal cytosoliskt mikrodomän av Ca2 ⁺ (Ca2 ⁺ puff ⁴⁾ eller, beroende på närheten till grann kluster av IP ₃ skivor, kan propagerar hela en cell genom att rekrytera flera puff platser genom en process av Ca2 ⁺ inducerad Ca2 ⁺ -release (CICR) ^5,6.

Införandet av fluorescerande liten molekyl Ca2 ⁺ indikator färgämnen som utvecklats av Roger Tsien ^7, i kombination med avancerad mikroskopi fantasinng tekniker, har i hög grad underlättat vår förståelse av Ca2 ⁺ signalering. Senaste framstegen inom kameror som används för mikroskopi tillåter nu för avbildning gående lokala Ca2 ⁺ händelser som puffar med oöverträffad rumslig och temporal upplösning. För närvarande tillgängliga EMCCD kameror möjliggör avbildning med 128 x 128 bildpunkter vid> 500 bildrutor sek ^-1 (fps) och den nya generationen av Complementary Metal-Oxide Semiconductor (CMOS) kameror ger högre pixelupplösning, och ännu snabbare hastighet på bekostnad av något högre bullernivåer. I samband med total inre reflektion (TIRF) mikroskopi är det nu möjligt att bilden singel Ca2 ⁺ kanalhändelser ^8,9. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt att avbilda hundratals kanaler / evenemang samtidigt, samtidigt som de skapar stora datamängder (ca 1Gb per minut) som gör manuell behandling, visuell identifiering och analys ogenomförbart och placera en skyldighet att utveckla automatiserade algoritmer.

<p class = "jove_content"> Här presenterar vi rutiner och protokoll för avbildning lokala ^{Ca2 +} signaler i intakta däggdjursceller med hjälp av fluorescerande ^{Ca2 +} indikatorer. Vi visar vidare en algoritm som utvecklats i öppen källkod miljö Python som automatiserar identifiering och analys av lokala Ca2 ⁺ evenemang avbildas av både TIRF och konventionell brett fält epi-fluorescens (WF) mikroskopi. Även om vi beskriver dessa tillvägagångssätt i samband med IP ₃ -generated Ca2 ⁺ signaler, de är lätt mottaglig för att studera lokala förändringar i cytosolisk [Ca2 ^+] som härrör från en mängd Ca2 ⁺ -permeable jonkanaler lokaliserade i endera ytan membran eller intracellulära organ ^8-10.

Protocol

Vi presenterar detaljerade förfaranden för avbildning lokala Ca2 + händelser i människans neuroblastom SH-SY5Y celler. Dessa förfaranden kan anpassas till bild intracellulära Ca2 + signaler i många celltyper 8-10. 1. Beredning av celler Kultur cellerna som ska avbildas enligt instruktioner som anges på deras leverantörs hemsida. Några dagar före avbildning, skörd celler odlas i en vävnadskultur kolv använder 1 ml 0,25% tryps…

Representative Results

Figur 1A visar en WF bild av vila Cal-520 fluorescens i humana neuroblastom SH-SY5Y celler också laddade med ci-IP 3. Exponering av dessa celler till en 100 ms UV flash till foto-release i-IP 3 framkallade övergående Ca2 + puffar på diskreta platser (noterats av de vita cirklarna i figur 1A). Fluorescens spår värderade till dessa platser visade en snabb stigande fas grund gående öppningar av IP 3 Rs, följt av en mycket långsammare fa…

Discussion

Vi beskriver här protokoll för avbildning lokala ^{Ca2 +} händelser i odlade däggdjursceller med hjälp av fluorescerande ^{Ca2 +} indikatorer. Dessutom beskriver vi en algoritm med ett intuitivt användargränssnitt som automatiserar identifiering och analys av insamlade data. Det förfarande som beskrivs här utnyttjar den fluorescerande Ca2 ⁺ indikator Cal-520, men många andra Ca2 ⁺ känsliga färgämnen såsom Fluo-3, Fluo-4, Fluo-8 och Oregon Grön BAPTA-1 utför tillräck…

Materials

Name	Company	Catalogue No.
Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells	ATCC	CRL-2266
Cal-520/AM	AAT Bioquest Inc.	21130
ci-IP3 (D-23-O-Isopropylidene-6-O-(2-nitro-4.5-dimethoxy)benzyl-myo-Inositol 145-trisphosphate-Hexakis(propionoxymethyl)	SiChem	cag-iso-2-145-10
DMSO/20% pluronic F127	Invitrogen	P-3000MP
EGTA/AM	Invitrogen	E-1219
35 mm glass-bottom imaging dishes	MatTek	P35-1.5-14-C