Chitosane / ARN interférant nanoparticules Mediated Gene Silencing dans la maladie vectorielle larves de moustiques
Summary
Nous décrivons ici une procédure pour inhiber la fonction des gènes chez les moustiques vecteurs de la maladie grâce à l'utilisation de chitosane / interférer nanoparticules d'ARN qui sont ingérés par les larves.
Abstract
moustiques vecteurs infligent des souffrances plus humain que ne importe quel autre organisme – et tuent plus d'un million de personnes chaque année. Les projets sur le génome de moustiques ont facilité la recherche dans de nouvelles facettes de la biologie des moustiques, y compris les études génétiques fonctionnels dans le principal vecteur africaine du paludisme Anopheles gambiae et de la dengue et le vecteur de la fièvre jaune Aedes aegypti. ARN de (RNAi-) le silençage génique médiation a été utilisée pour cibler des gènes d'intérêt dans ces deux espèces de moustiques vecteurs de maladies. Ici, nous décrivons une procédure pour la préparation de chitosane / ARN interférant nanoparticules qui sont combinés avec de la nourriture et ingérés par les larves. Ceci, à haut débit techniquement simple et relativement peu coûteux méthodologie, qui est compatible avec de longs ARN double brin (ARNdb) ou de petits ARN interférents (siARN) de molécules, a été utilisé pour le knock-down réussi d'un certain nombre de différents gènes dans A. gambiae et A. aegyptilarves. Après tétées larvaires, démontable, qui est vérifiée par qRT-PCR ou hybridation in situ, peuvent persister au moins jusqu'à la fin du stade de pupe. Cette méthode peut se appliquer à une grande variété de moustique et d'autres espèces d'insectes, y compris les parasites agricoles, ainsi que d'autres organismes non-modèles. En plus de son utilité dans le laboratoire de recherche, à l'avenir, le chitosane, un polymère peu coûteux, non toxique et biodégradable, susceptibles d'être utilisés dans le domaine.
Introduction
moustiques vecteurs de l'alimentation sanguine des genres anophèles et Aedine transmettent agents responsables de plusieurs des pires fléaux de l'humanité pathogènes. On estime que 3,4 milliards de personnes sont à risque de contracter le paludisme, qui est responsable de plus d'un demi-million de décès chaque année dans le monde entier. les résultats de la lutte contre le paludisme de l'infection par Plasmodium sp., des parasites qui sont transmis à l'homme par les piqûres de moustiques infectés du genre Anopheles, y compris le principal vecteur africain Anopheles gambiae ( http://www.who.int/topics/malaria/en/ , 2014) 1. Aedes aegypti est le moustique vecteur principal de virus de la dengue, qui provoque de la fièvre de la dengue, une maladie fébrile non spécifique qui est l'arbovirose la plus répandue et importante dans le monde. virus de la dengue est actuellement une menace pour> 2,5 milliards de personnes dans les tropiques, avec une façon fortuite annuelleCE d'environ 50 millions de cas résultant en ~ 24 000 décès par an ( http://www.cdc.gov/dengue/ , 2014) 2. Malgré l'impact mondial dévastateur de maladies transmises par les moustiques sur la santé humaine, des moyens efficaces de prévention et de traitement de ces maladies font défaut. lutte contre les moustiques est actuellement la meilleure méthode de prévention de la maladie.
Le potentiel de lutte contre les maladies transmises par les arthropodes par la manipulation génétique des insectes vecteurs a été reconnue depuis plus de quatre décennies 3. Souches transgéniques de A. aegypti conçu pour avoir un phénotype spécifique de voler-femme répressible ont récemment fait la possibilité d'utiliser des stratégies de lutte antivectorielle transgéniques une réalité 4-6. Ces progrès ont contesté les chercheurs à identifier les cibles génétiques nouvelles pour la lutte antivectorielle et des moyens supplémentaires de manipuler la fonction des gènes chez les moustiques vecteurs. Altération de l'expression des gènes ddéveloppement ors, comme ce était le cas chez les moustiques femelles de 4-voler, peut promouvoir l'élucidation des stratégies de lutte antivectorielle nouveaux. Cependant, en grande partie en raison de problèmes techniques, les fonctions de très peu de gènes ont été caractérisées au cours du développement de A. gambiae, A. aegypti, ou d'autres espèces de moustiques.
Depuis sa découverte en C. elegans 7, l'ARN interférence (ARNi), qui est conservé chez les animaux, les plantes et les micro-organismes, a été largement utilisé pour des études génétiques fonctionnelles dans une grande variété d'organismes, y compris les insectes 8,9. La voie ARNi est initiée par Dicer, qui clive à long ARN double brin en courts 20-25 siRNA nucléotidiques de long qui fonctionnent comme des ARN interférents séquence-spécifique. gènes de silence siRNA qui sont complémentaires dans l'ordre par la promotion de chiffre d'affaires de la transcription, le clivage et la perturbation de la traduction 9. Longues molécules ARN double brin (typiquement 300-600 pb) ou personnalisés siRNA ciblant un particulièremenr séquence peut être utilisée dans le laboratoire de recherche pour faire taire ne importe quel gène d'intérêt. En gérant lorsque ARN interférent est livré, les chercheurs peuvent contrôler l'heure à laquelle silençage génique initiés. Cet avantage est utile car elle peut être utilisée pour surmonter des défis tels que la létalité de développement ou de stérilité, ce qui peut entraver la production et l'entretien des souches portant des mutations héréditaires, un processus coûteux et de main-d'œuvre qui ne est pas encore disponible dans toutes les espèces d'insectes. Bien que le degré de silençage génique par ARNi peut varier de gène à gène, un tissu à tissu, et un animal à l'ARNi est largement utilisé pour l'analyse fonctionnelle des gènes dans les moustiques et autres insectes 8,9.
Trois stratégies d'interférence de livraison d'ARN ont été utilisés dans les moustiques: micro-injection, l'application trempage / topique, et ingestion. Pour une histoire détaillée et une comparaison de l'utilisation de ces trois techniques chez les insectes, se il vous plaît se référer à Yu et al 8. We ont utilisé avec succès la micro-injection 10 comme un moyen de fournir des siRNA pour cibler les gènes du développement chez A. aegypti embryons, larves, pupes et 11-14. Cependant, cette stratégie de prestation de main-d'œuvre exige à la fois une installation de micro-injection et une main habile. En outre, la micro-injection est stressant pour l'organisme, un facteur de confusion, en particulier lorsque phénotypes comportementaux seront évalués. Enfin, la livraison de micro-injection ne peut pas être étendu au domaine de la lutte antivectorielle. Comme alternative, le trempage l'organisme en interférant solution d'ARN est également devenu un moyen populaire d'induire le silençage génique, car il est pratique et nécessite peu d'équipement ou la main-d'œuvre. Le trempage a surtout été appliquée dans la lignée cellulaire d'insectes étudie 8, mais dans une étude récente, knockdown a été atteint en A. larves de aegypti immergé dans une solution de 15 l'ARN double brin, où les animaux semblaient être ingéré. Cependant, les études portant sur l'analyse de plusieurs experimentagroupes de L ou phénotypes, le trempage est assez coûteux. Lopez-Martinez et al. 16 décrit réhydratation entraîné ARNi, une nouvelle approche pour la livraison de l'ARN interférant qui implique la déshydratation dans une solution saline et la réhydratation avec une seule goutte d'eau contenant de l'ARN interférant. Cette approche ne coupe les coûts associés à l'immersion de l'animal entier, mais est plus cher que la micro-injection et peut être limitée dans son application aux espèces qui peuvent tolérer fortes pressions osmotiques. En outre, il est difficile d'imaginer comment l'immersion ou la méthode d'immersion / de réhydratation de déshydratation pourraient être adaptées pour la lutte antivectorielle dans le domaine. Pour ces raisons, pour les études post-embryonnaires, la livraison des ARN interférant avec de la nourriture ingérée est une stratégie alternative viable.
Bien que des stratégies fondées sur l'ingestion-ne fonctionnent pas chez toutes les espèces d'insectes, peut-être surtout Drosophila melanogaster, l'administration orale d'ARN interférents mélangé avec de la nourriture a favorisé si géniquelencing dans une variété d'insectes 8,17, y compris A. aegypti adultes 18. Nous avons décrit des nanoparticules de chitosan à médiation par ARNi dans A. gambiae larves 19 et ont appliqué avec succès cette approche pour la réduction de l'expression génique dans A. aegypti larves 20,21. Ici, la méthodologie pour cette procédure ARNi, qui consiste à piéger des ARN interférents par le chitosane de polymère, est détaillée. Chitosan / ARN interférents nanoparticules sont formées par auto-assemblage de polycations avec des ARN interférent par les forces électrostatiques entre les charges positives des groupes amino dans le chitosane et les charges négatives portées par les groupes phosphate sur le squelette de 19 l'ARN interférent. La procédure décrite est compatible avec les molécules d'ARNdb longs (ci-après dénommée ARN double brin) ou double brin siRNA (ci-après dénommé siRNA). Après la synthèse, le chitosane / interférents nanoparticules d'ARN sont mélangés avec de la nourriture des larves et livrés àlarves à l'ingestion. Cette méthodologie est relativement peu coûteux, nécessite peu de matériel et la main-d'œuvre 19, et facilite l'analyse à haut débit de plusieurs phénotypes, incluant l'analyse des comportements 20,21. Cette méthode, qui peut être adaptée pour les études d'inactivation de gène dans d'autres insectes, y compris d'autres vecteurs de maladies et les insectes nuisibles agricoles, pourrait être utilisée pour le silençage génique dans une variété d'autres espèces animales. En outre, le chitosane, un polymère peu coûteux, non toxique et biodégradable 22, pourrait être utilisée dans le domaine de lutte contre les moustiques spécifique de l'espèce.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le / interférer méthodologie de nanoparticules d'ARN de chitosane décrit ici a été utilisé pour cibler efficacement les gènes au cours du développement larvaire dans A. gambiae (figures 2, 3) et A. aegypti (figures 4, 5, 6 et aux tableaux 1, 2). Des nanoparticules de chitosan peuvent être préparées avec soit longue ou siRNA ARN double brin, qui ont tous deux été utilisés avec succès dans les moustiques comme en témoignent les résultats représentat…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding from the Kansas Agricultural Experiment Station and K-State Arthropod Genomics Center to KYZ supported the original development of chitosan/dsRNA-mediated gene silencing in A. gambiae19.The A. gambiae work described here was supported in part by R01-AI095842 from NIH/NIAID to KM. Development of chitosan/siRNA-mediated gene silencing in A. aegypti20,21 was supported by NIH/NIAID Award R01-AI081795 to MDS. The contents of this study are solely the responsibility of the authors and do not necessarily represent the official views of the NIH.
Materials
| Name of Reagent/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Descriptions |
| 0.02 ml pipetteman | Rainin | PR20 | for resuspension of interfering RNA |
| 0.2 ml pipetteman | Rainin | PR200 | for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| 0.5 ml graduated tube | Fischer Scientific | 05-408-120 | for aliquoting resuspended interfering RNA |
| 1 ml pipetteman | Rainin | PR1000 | for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| 1.5 ml graduated tube | Fischer Scientific | 05-408-046 | for preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| 1M Sodium Acetate, pH 4.5 | TEKnova | S0299 | to prepare sodium acetate buffer |
| Acetic Acid, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grade | BDH | VWR BDH3092-500MLP | to prepare sodium acetate buffer |
| Agarose Genetic Technology Grade | MP Biomedicals LLC. | 800668 | to coat prepared interfering RNA/nanoparticles |
| Centrifuge | Eppendorf AG | 5415D | to pellet interfering RNA/nanoparticles |
| Chitosan, from shrimp shells | Sigma-Aldrich | C3646-25G | to combine with interfering RNA for prepararation of interfering RNA/nanoparticles |
| Dry Yeast | Universal Food Corp | NA | to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles |
| E-RNAi tool | German Cancer Research Center | NA | for design of dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3// |
| goldfish food | Wardley | Goldfish FLAKE FOOD | to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles |
| Heated water bath | Thermo Scientific | 51221048 | to heat the interfering RNA/nanoparticles at 55oC |
| Ice | not applicable | not applicable | for thawing interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| Ice bucket | Fisher Scientific | 02-591-44 | for storage of ice used during the procedure |
| liver powder | MP Biomedicals LLC. | 900396 | to feed mosquito larvae post interfering RNA/nanoparticle treatment |
| Microwave oven | A variety of vendors | not applicable | to prepare 2% agarose solution |
| petridish (100X15 mm) | Fischer Scientific | 875713 | interfering RNA/nanoparticle feeding chamber for larvae |
| pH meter | Mettler Toledo | S220 | for preparation of buffers |
| Razor blade | Fischer Scientific | 12-640 | to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings |
| siRNA | Thermo Scientific/Dharmacon | custom | for preparation of siRNA/nanoparticles |
| Sodium Sulfate, Anhydrous (Na2SO4) | BDH/distributed by VWR | VWR BDH0302-500G | to prepare 50mM sodium sulfate solution in which the interfering RNA will be resuspended |
| Thermometer | VWR | 61066-046 | to measure the water bath temperature |
| Tooth picks | VWR | 470146-908 | for stirring during interfering RNA/nanoparticle food preparation and cutting gel pellets |
| Ultralow freezer | A variety of vendors | not applicable | for storage of interfering RNA aliquots and interfering RNA/nanoparticles at -80oC |
| Vortex mixer | Fischer Scientific | 02-216-108 | for preparation of chitosan/interfering RNA |
| Weight paper | Fischer Scientific | NC9798735 | to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings |
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