रोगवाहक मच्छरों का लार्वा में chitosan / दखल शाही सेना nanoparticle के मध्यस्थता जीन मुंह बंद
Summary
यहाँ हम लार्वा द्वारा किया जाता है कि शाही सेना नैनोकणों / chitosan के उपयोग के माध्यम से रोग वेक्टर मच्छरों में जीन समारोह में बाधा हस्तक्षेप के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन है।
Abstract
वेक्टर मच्छरों किसी अन्य जीव की तुलना में अधिक मानवीय पीड़ा दण्ड – और एक लाख से अधिक लोगों को हर साल मार डालते हैं। मच्छर जीनोम परियोजनाओं प्राथमिक अफ्रीकी मलेरिया वेक्टर एनोफ़ेलीज़ gambiae और डेंगू और पीत ज्वर वेक्टर एडीज एजिप्टी में कार्यात्मक आनुवंशिक अध्ययनों सहित मच्छर जीव विज्ञान के नए पहलुओं में अनुसंधान में मदद की। शाही सेना interference- (RNAi-) मध्यस्थता जीन मुंह बंद करने के लिए इन बीमारी वेक्टर मच्छर प्रजातियों में से दोनों में ब्याज की जीन लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। यहाँ, हम भोजन के साथ संयुक्त और लार्वा द्वारा किया जाता है कि शाही सेना नैनोकणों दखल / chitosan की तैयारी के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन। लंबी डबल असहाय शाही सेना (dsRNA) या छोटे दखल शाही सेना (siRNA) के अणुओं के साथ संगत है जो इस तकनीकी रूप से सरल, उच्च throughput, और अपेक्षाकृत सस्ती पद्धति, ए में विभिन्न जीनों के एक नंबर के सफल पछाड़ना के लिए इस्तेमाल किया गया है gambiae और ए एजिप्टीQRT- पीसीआर के माध्यम से या स्वस्थानी संकरण में सत्यापित है जो लार्वा। लार्वा feedings के बाद, पछाड़ना, कम से कम देर से पोटा संबंधी मंच के माध्यम से बच सकते हैं। इस पद्धति एक मच्छर और कृषि कीटों सहित अन्य कीट प्रजातियों की व्यापक विविधता है, साथ ही अन्य गैर-मॉडल जीवों के लिए लागू किया जा सकता है। अनुसंधान प्रयोगशाला में इसकी उपयोगिता के अलावा, भविष्य, Chitosan, एक सस्ती, गैर विषैले और जैव बहुलक में, संभावित क्षेत्र में उपयोग किया जा सकता है।
Introduction
Anopheline और Aedine पीढ़ी के रक्त खिला वेक्टर मच्छरों मानव जाति की सबसे खराब संकट के कई के लिए जिम्मेदार रोग के कारण एजेंट संचारित। एक अनुमान के अनुसार 3.4 अरब लोगों को प्रतिवर्ष दुनिया भर के एक से डेढ़ लाख लोगों की मृत्यु के लिए जिम्मेदार है, जो मलेरिया, करार के लिए खतरा हैं। प्लाज्मोडियम सपा द्वारा संक्रमण से मलेरिया का परिणाम है। प्रिंसिपल अफ्रीकी वेक्टर एनोफ़ेलीज़ gambiae सहित (एनोफ़ेलीज़ जीनस के संक्रमित मच्छरों के काटने के माध्यम से लोगों को प्रेषित कर रहे हैं जो परजीवी, http://www.who.int/topics/malaria/en/ 2014) 1। एडीज एजिप्टी डेंगू बुखार, दुनिया में सबसे व्यापक और महत्वपूर्ण arboviral रोग है कि एक अविशिष्ट ज्वर बीमारी का कारण बनता है, जो डेंगू वायरस, के लिए प्राथमिक मच्छर वेक्टर है। डेंगू वायरस एक वार्षिक inciden साथ, वर्तमान में उष्णकटिबंधीय में> 2.5 अरब लोगों के लिए खतरा है24,000 लोगों की मृत्यु सालाना ~ में जिसके परिणामस्वरूप लगभग 50 लाख मामलों के सीई ( http://www.cdc.gov/dengue/ , 2014) 2। मानव स्वास्थ्य पर मच्छर जनित बीमारियों के विनाशकारी वैश्विक प्रभाव के बावजूद, को रोकने और इन बीमारियों के इलाज की कारगर साधन की कमी है। मच्छर नियंत्रण वर्तमान में बीमारी की रोकथाम का सबसे अच्छा तरीका है।
वेक्टर कीड़ों की आनुवंशिक हेरफेर द्वारा सन्धिपाद जनित रोगों को नियंत्रित करने के लिए संभावित चार दशकों से अधिक 3 के लिए मान्यता दी गई है। ए के ट्रांसजेनिक उपभेदों हाल ही में ट्रांसजेनिक वेक्टर नियंत्रण रणनीति एक वास्तविकता 4-6 उपयोग करने के लिए संभावित बना दिया है एजिप्टी एक repressible महिला-विशिष्ट उड़ान फेनोटाइप है करने के लिए इंजीनियर। ये प्रगति वेक्टर नियंत्रण और वेक्टर मच्छरों में जीन समारोह में हेर-फेर के अतिरिक्त साधन के लिए उपन्यास आनुवंशिक लक्ष्यों की पहचान करने के लिए शोधकर्ताओं ने चुनौती दी है। जीन अभिव्यक्ति डी का बदलावमहिला-उड़ान मच्छरों 4 में मामला था uring विकास, उपन्यास वेक्टर नियंत्रण रणनीति की व्याख्या को बढ़ावा देने के कर सकते हैं। हालांकि, बड़े पैमाने पर होने के कारण तकनीकी चुनौतियों के लिए, बहुत कुछ जीनों के कार्यों ए के विकास के दौरान विशेषता किया गया है gambiae, ए एजिप्टी, या अन्य मच्छर प्रजातियों।
सी में इसकी खोज के बाद से एलिगेंस 7, पशुओं, पौधों, और सूक्ष्मजीवों में संरक्षित है जो शाही सेना हस्तक्षेप (आरएनएआई), बड़े पैमाने पर कीड़ों 8,9 सहित जीवों की एक विस्तृत विविधता में कार्यात्मक आनुवंशिक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है। आरएनएआई मार्ग अनुक्रम विशिष्ट दखल शाही सेना के रूप में कार्य है कि कम 20-25 न्यूक्लियोटाइड-लंबे siRNAs में पासा खेलनेवाला, जो cleaves लंबे dsRNA द्वारा शुरू की है। प्रतिलेख कारोबार, दरार, और अनुवाद 9 के विघटन को बढ़ावा देकर अनुक्रम में पूरक हैं कि siRNAs चुप्पी जीनों। एक particula को लक्षित लंबे dsRNA अणुओं (आमतौर पर 300-600 बीपी) या कस्टम siRNAsआर अनुक्रम हित के किसी भी जीन मुंह बंद करने के लिए अनुसंधान प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया जा सकता है। शाही सेना वितरित किया जाता है दखल जब प्रबंध करके, शोधकर्ताओं, जो जीन में शुरू मुंह बंद करने के समय को नियंत्रित कर सकते हैं। यह उत्पादन और पैतृक म्यूटेशन, अभी तक सभी कीट प्रजातियों में उपलब्ध नहीं है कि एक महंगी और श्रम प्रधान प्रक्रिया असर उपभेदों के रखरखाव में बाधा कर सकते हैं, जो इस तरह के विकास की मारक या बाँझपन के रूप में चुनौतियों को दूर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में यह लाभ उपयोगी है। आरएनएआई द्वारा जीन मुंह बंद करने की डिग्री जानवर के लिए जीन, ऊतक के लिए ऊतक, और जानवर के लिए जीन से भिन्न हो सकता है, आरएनएआई व्यापक रूप से मच्छरों और अन्य कीड़ों 8,9 में जीन की कार्यात्मक विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है।
तीन दखल शाही सेना वितरण रणनीतियों मच्छरों में इस्तेमाल किया गया है: microinjection, भिगोने / सामयिक आवेदन, और घूस। एक विस्तृत इतिहास और कीड़ों में इन तीन तकनीकों के उपयोग की तुलना के लिए, यू एट अल 8 को देखें। डब्ल्यूई सफलतापूर्वक ए में विकासात्मक जीनों को लक्षित करने के siRNAs देने के एक साधन के रूप में microinjection के 10 का इस्तेमाल किया है एजिप्टी भ्रूण, लार्वा, और pupae 11-14। हालांकि, इस श्रम प्रधान वितरण रणनीति एक microinjection सेटअप और एक कुशल हाथ दोनों की आवश्यकता है। इसके अलावा, microinjection के व्यवहार phenotypes के मूल्यांकन किया जाएगा, खासकर जब जीव, एक confounding कारक के लिए तनावपूर्ण है। अंत में, microinjection के वितरण वेक्टर नियंत्रण के लिए क्षेत्र के लिए बढ़ाया नहीं जा सकता। यह सुविधाजनक है और छोटे से उपकरण या श्रम की आवश्यकता के रूप में एक विकल्प के रूप में शाही सेना समाधान दखल में जीव भिगोने भी, जीन मुंह बंद उत्प्रेरण का एक लोकप्रिय साधन बन गया है। भिगोने मुख्य रूप से कीट सेल लाइन में लागू किया गया है 8 अध्ययन है, लेकिन हाल के एक अध्ययन में, पछाड़ना ए में हासिल की थी एजिप्टी लार्वा जानवरों ingesting जा दिखाई जो dsRNA 15, की एक समाधान में डूबे। हालांकि, कई experimenta के विश्लेषण शामिल अध्ययन के लिएएल समूहों या phenotypes, भिगोने बल्कि महंगा है। लोपेज-मार्टिनेज एट अल। 16 आरएनएआई, दखल शाही सेना युक्त पानी की एक बूंद के साथ नमकीन घोल और पुनर्जलीकरण में निर्जलीकरण शामिल है कि शाही सेना वितरण हस्तक्षेप के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण संचालित पुनर्जलीकरण का वर्णन किया। यह दृष्टिकोण पूरी पशु विसर्जन के साथ जुड़े लागत में कटौती, लेकिन microinjection से ज्यादा महंगा है और उच्च आसमाटिक दबाव के बर्दाश्त कर सकते हैं कि प्रजातियों के लिए अपने आवेदन में सीमित किया जा सकता करता है। इसके अलावा, यह विसर्जन या निर्जलीकरण / पुनर्जलीकरण विसर्जन कार्यप्रणाली क्षेत्र में वेक्टर नियंत्रण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कि कैसे कल्पना करना मुश्किल है। इन कारणों के लिए, के बाद भ्रूण के अध्ययन के लिए, भोजन किया जाता के साथ शाही सेना हस्तक्षेप के वितरण के लिए एक व्यवहार्य विकल्प रणनीति है।
घूस आधारित रणनीतियों सभी कीट प्रजातियों, शायद सबसे विशेष रूप से ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में काम नहीं करते हैं, भोजन के साथ मिश्रित आरएनए हस्तक्षेप की मौखिक वितरण जीन एसआई को बढ़ावा दिया हैकीड़े 8,17 की एक किस्म में lencing, सहित ए एजिप्टी वयस्कों 18। हम ए में chitosan nanoparticle की मध्यस्थता आरएनएआई वर्णित gambiae लार्वा 19 और सफलतापूर्वक ए में जीन की अभिव्यक्ति की कमी के लिए इस दृष्टिकोण आवेदन किया है एजिप्टी लार्वा 20,21। इधर, बहुलक chitosan के द्वारा आरएनए हस्तक्षेप की entrapping शामिल है जो इस आरएनएआई प्रक्रिया के लिए कार्यप्रणाली, विस्तृत है। Chitosan / दखल शाही सेना नैनोकणों chitosan में एमिनो समूहों के सकारात्मक शुल्क और शाही सेना के 19 दखल की रीढ़ की हड्डी पर फॉस्फेट समूहों द्वारा किए गए नकारात्मक आरोपों के बीच electrostatic बल के माध्यम से शाही सेना के हस्तक्षेप के साथ polycations की आत्म विधानसभा द्वारा गठित कर रहे हैं। वर्णित प्रक्रिया लंबे dsRNA अणुओं (इसके बाद siRNA के रूप में संदर्भित) siRNA फंसे (इसके बाद dsRNA के रूप में) या डबल दोनों के साथ संगत है। निम्नलिखित संश्लेषण, chitosan / दखल शाही सेना नैनोकणों लार्वा खाने के साथ मिलाया जाता है और करने के लिए वितरित कर रहे हैंमौखिक घूस के माध्यम से लार्वा। इस पद्धति, अपेक्षाकृत सस्ती है थोड़ा उपकरण और श्रम 19 की आवश्यकता है, और व्यवहार 20,21 के विश्लेषण सहित कई phenotypes के उच्च throughput विश्लेषण की सुविधा। अन्य रोग वैक्टर और कीट कृषि कीटों सहित अन्य कीड़े, में जीन मुंह बंद करने के अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जो इस पद्धति, संभवतः अन्य जानवरों की प्रजातियों की एक किस्म में जीन मुंह बंद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, Chitosan, एक सस्ता, गैर विषैले और biodegradable बहुलक 22 संभावित प्रजाति विशिष्ट मच्छर नियंत्रण के लिए क्षेत्र में उपयोग किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस के साथ साथ वर्णित chitosan / दखल शाही सेना nanoparticle कार्यप्रणाली को प्रभावी ढंग से ए में लार्वा विकास के दौरान जीन लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है gambiae (आंकड़े 2, 3) और ए एजिप्टी (आंकड़े 4, 5…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding from the Kansas Agricultural Experiment Station and K-State Arthropod Genomics Center to KYZ supported the original development of chitosan/dsRNA-mediated gene silencing in A. gambiae19.The A. gambiae work described here was supported in part by R01-AI095842 from NIH/NIAID to KM. Development of chitosan/siRNA-mediated gene silencing in A. aegypti20,21 was supported by NIH/NIAID Award R01-AI081795 to MDS. The contents of this study are solely the responsibility of the authors and do not necessarily represent the official views of the NIH.
Materials
| Name of Reagent/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Descriptions |
| 0.02 ml pipetteman | Rainin | PR20 | for resuspension of interfering RNA |
| 0.2 ml pipetteman | Rainin | PR200 | for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| 0.5 ml graduated tube | Fischer Scientific | 05-408-120 | for aliquoting resuspended interfering RNA |
| 1 ml pipetteman | Rainin | PR1000 | for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| 1.5 ml graduated tube | Fischer Scientific | 05-408-046 | for preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| 1M Sodium Acetate, pH 4.5 | TEKnova | S0299 | to prepare sodium acetate buffer |
| Acetic Acid, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grade | BDH | VWR BDH3092-500MLP | to prepare sodium acetate buffer |
| Agarose Genetic Technology Grade | MP Biomedicals LLC. | 800668 | to coat prepared interfering RNA/nanoparticles |
| Centrifuge | Eppendorf AG | 5415D | to pellet interfering RNA/nanoparticles |
| Chitosan, from shrimp shells | Sigma-Aldrich | C3646-25G | to combine with interfering RNA for prepararation of interfering RNA/nanoparticles |
| Dry Yeast | Universal Food Corp | NA | to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles |
| E-RNAi tool | German Cancer Research Center | NA | for design of dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3// |
| goldfish food | Wardley | Goldfish FLAKE FOOD | to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles |
| Heated water bath | Thermo Scientific | 51221048 | to heat the interfering RNA/nanoparticles at 55oC |
| Ice | not applicable | not applicable | for thawing interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| Ice bucket | Fisher Scientific | 02-591-44 | for storage of ice used during the procedure |
| liver powder | MP Biomedicals LLC. | 900396 | to feed mosquito larvae post interfering RNA/nanoparticle treatment |
| Microwave oven | A variety of vendors | not applicable | to prepare 2% agarose solution |
| petridish (100X15 mm) | Fischer Scientific | 875713 | interfering RNA/nanoparticle feeding chamber for larvae |
| pH meter | Mettler Toledo | S220 | for preparation of buffers |
| Razor blade | Fischer Scientific | 12-640 | to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings |
| siRNA | Thermo Scientific/Dharmacon | custom | for preparation of siRNA/nanoparticles |
| Sodium Sulfate, Anhydrous (Na2SO4) | BDH/distributed by VWR | VWR BDH0302-500G | to prepare 50mM sodium sulfate solution in which the interfering RNA will be resuspended |
| Thermometer | VWR | 61066-046 | to measure the water bath temperature |
| Tooth picks | VWR | 470146-908 | for stirring during interfering RNA/nanoparticle food preparation and cutting gel pellets |
| Ultralow freezer | A variety of vendors | not applicable | for storage of interfering RNA aliquots and interfering RNA/nanoparticles at -80oC |
| Vortex mixer | Fischer Scientific | 02-216-108 | for preparation of chitosan/interfering RNA |
| Weight paper | Fischer Scientific | NC9798735 | to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings |
Riferimenti
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