病気のベクトル蚊幼虫におけるキトサン/干渉RNAナノ粒子媒介遺伝子サイレンシング
Summary
ここでは、幼虫により摂取されたキトサン/干渉RNAナノ粒子の使用を通じて疾病媒介蚊で遺伝子機能を阻害するための手順を記述している。
Abstract
媒介蚊は、他の生物よりも多くの人的被害を与える–と百万人以上の人毎年殺す。蚊のゲノムプロジェクトは、プライマリアフリカのマラリアベクトルハマダラカとデング熱や黄熱病ベクトルネッタイシマカにおける機能遺伝子研究を含め、蚊の生物学の新しいファセットの研究を促進した。電波妨害RNA（RNAiを）媒介遺伝子サイレンシングは、これらの疾患の媒介蚊の種の両方において、目的の遺伝子を標的とするために使用されてきた。ここでは、食物と一緒にし、幼虫により摂取されたキトサン/干渉RNAナノ粒子の調製のための手順を記載している。長い二本鎖RNA（dsRNA）または低分子干渉RNA（siRNA）分子と互換性があり、この技術的に簡単で、高スループット、比較的安価な方法は、Aの異なるいくつかの遺伝子のノックダウンの成功のために使用されているハマダラカとA.ネッタイシマカ幼虫。定量RT-PCRを介して、またはin situハイブリダイゼーションで確認された幼虫授乳、ノックダウン、続いて、少なくとも後半蛹を通 じて持続することができます。この方法は、農業害虫、並びに他の非モデル生物を含む蚊および他の昆虫種の多種多様に適用可能である。研究室でのその有用性に加えて、将来、キトサン、安価な、非毒性および生分解性ポリマー中に、潜在的な分野で利用することができる。
Introduction
ハマダラカとAedine属の血液供給の媒介蚊は、人類の最悪の災いのいくつかの責任病気の原因となる物質を伝達する。推定34億の人々が毎年世界中でオーバーワン50万人の死亡の原因であるマラリアを、縮小するための危険にさらされている。 マラリア原虫属による感染からマラリアの結果。主要なアフリカのベクトルハマダラカ （含むハマダラカ属の感染した蚊の刺さを通じて人々に送信され、寄生虫、 http://www.who.int/topics/malaria/en/ 、2014）1。 ネッタイシマカは、デング熱、世界で最も広範かつ重要なアルボウイルス疾患である非特異的な熱性疾患の原因となるデング熱ウイルス、の主要な蚊ベクトルである。デング熱ウイルスは毎年incidenで、現在熱帯> 25億人への脅威である毎年〜24000人が死亡（結果として約5000万例のCE http://www.cdc.gov/dengue/ 、2014）2。人の健康に蚊が媒介する病気の壊滅的な世界的な影響にもかかわらず、これらの疾患の予防及び治療の効果的な手段が不足している。モスキートコントロールは、現在、病気の予防の最善の方法です。
ベクトル昆虫の遺伝子操作によって節足動物媒介疾患を制御するための可能性は40年以上3認識されてきた。 A.のトランスジェニック系統抑制性女性特有飛べ表現型を有するように操作ネッタイシマカは、最近、トランスジェニックベクターコントロール戦略現実4-6を使用するための可能性を作った。これらの進歩は、ベクター対照と媒介蚊で遺伝子機能を操作するさらなる手段のための新規の遺伝子標的を同定するために研究者が挑戦してきた。遺伝子発現dの変質を雌飛べ蚊4でそうであったようにuring開発は、新規ベクトル制御戦略の解明を促進することができる。しかし、主として技術的な課題に、非常に少数の遺伝子の機能は、Aの開発中に特徴付けられているハマダラカ、ネッタイシマカ、または他の蚊の種。
C.年の発見以来エレガンス 7、動物、植物および微生物において保存されているRNA干渉（RNAi）は、広範囲の昆虫8,9を含む多種多様な生物において機能的な遺伝学的研究のために使用されてきた。 RNAi経路は、配列特異的干渉RNAとして機能する短い20-25ヌクレオチド長のsiRNAに切断する長いdsRNAダイサーによって開始される。転写産物のターンオーバー、切断、および翻訳9の破壊を促進することにより、配列が相補的であるsiRNAは沈黙遺伝子。 particulaをターゲットに長いdsRNA分子（通常は300〜600塩基対）、またはカスタムのsiRNArの配列は、目的の任意の遺伝子をサイレンシングするために研究室で使用することができる。干渉RNAが送達されたときに管理することにより、研究者は、遺伝子がサイレンシングを開始する時間を制御することができる。それは遺伝変異を有する株の生産やメンテナンス、すべての昆虫種ではまだ使用できません高価で労働集約的なプロセスを妨げることができるように、発達致死や無菌性などの課題を克服するために使用することができようにこの利点に便利です。 RNAiによる遺伝子サイレンシングの程度は、動物への遺伝子、組織、組織、および動物に遺伝子変化し得るが、RNAiは広く蚊や他の昆虫8,9における遺伝子の機能解析のために使用される。
三つの干渉RNA送達戦略は、蚊に使用されてきた：微量注入、浸漬/局所適用、経口摂取を。詳細な歴史と昆虫におけるこれらの3つの技術の利用の比較のために、ゆうら 8を参照してください。 Weは成功してAの発生遺伝子をターゲットとするsiRNAを送達する手段としてマイクロインジェクション10を使用していたネッタイシマカの胚、幼虫、蛹11-14。しかし、この労働集約的な配信戦略は、マイクロインジェクションのセットアップと熟練した手の両方を必要とします。また、マイクロインジェクションは、行動の表現型が評価される場合は特に、生物、交絡因子にストレスが多い。最後に、マイクロインジェクション送達は、ベクトル制御のためのフィールドを拡張することができない。それは便利であり、ほとんどの機器や労力を必要とする別の方法として、RNA溶液を干渉する生物を浸すことはまた、遺伝子サイレンシングを誘導する人気の手段となっている。浸漬は、主に昆虫細胞株に適用された8を研究が、最近の研究では、ノックダウンA.で達成されたネッタイシマカの幼虫は、動物が摂取するように思われたdsRNA 15の溶液に浸漬した。ただし、複数のエクスペリの分析を含む研究のためのL基または表現型は、浸漬はかなり高価である。ロペス·マルティネスら 16は、RNAi、干渉RNAを含む水の一滴と食塩水と水分補給で脱水を伴うRNAの配信を妨害するための新規のアプローチを駆動水分補給を説明した。このアプローチは、動物全体の浸漬に関連するコストを削減するが、マイクロインジェクションよりも高価であり、高い浸透圧に耐えることができる化学種への適用に限定されてもよいしない。また、浸漬、脱水/再水和の浸漬方法は、フィールド内のベクトル制御に適合させることができるか想像することは困難である。これらの理由から、後胚の研究のために、摂取した食物との干渉RNAの送達は実行可能な代替戦略です。
摂取ベースの戦略は、すべての昆虫種では動作しませんが、おそらく最も顕著キイロショウジョウバエ 、食品と混合したRNA干渉の経口送達は、遺伝子のSiを推進してきましたA.含む昆虫8,17、さまざまなlencing ネッタイシマカ大人18。私たちは、Aにキトサンナノ粒子媒介RNAiを説明したハマダラカ幼虫 19に成功A.における遺伝子発現の低減のためのこのアプローチを適用しているネッタイシマカの幼虫20,21。ここで、高分子キトサンによるRNA干渉の包括を伴うこのRNAiの手順、方法論は、詳細です。キトサン/干渉RNAナノ粒子は、キトサン中のアミノ基の正電荷とRNA 19干渉の主鎖にリン酸基により担持された負電荷間の静電力を介して干渉RNAとポリカチオンの自己集合により形成される。記載された手順は、長いdsRNA分子（以下のdsRNAとも呼ばれる）または二本鎖siRNA（以下のsiRNAと呼ばれる）の両方と互換性がある。以下の合成、キトサン/ RNAナノ粒子が幼虫食品と混合に配信される干渉経口摂取を通じて幼虫。この方法は、比較的安価であり、少ない設備および労力19を必要とし、行動20,21の解析を含む複数の表現型のハイスループット分析を容易にする。他の疾患ベクターおよび昆虫農業害虫を含む他の昆虫の遺伝子サイレンシング研究のために適合させることができるこの方法は、潜在的に他の種々の動物種における遺伝子サイレンシングのために使用することができる。また、キトサン、安価な、非毒性および生分解性ポリマー22は 、潜在的に種特異的な蚊の駆除のための分野において利用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
本明細書に記載のキトサン/干渉RNAナノ粒子法は、効果的にAの発育中の遺伝子を標的とするために使用されているハマダラカ （ 図2、図3）およびA.ネッタイシマカ （ 図4、図5、図6、表1、表2）。キトサンナノ粒子は、本明細書に記載の代表的な結果によって証明されるように蚊に成功裡に使用されている両方とも、長いdsRNAまたはsiRNAのいずれか?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding from the Kansas Agricultural Experiment Station and K-State Arthropod Genomics Center to KYZ supported the original development of chitosan/dsRNA-mediated gene silencing in A. gambiae19.The A. gambiae work described here was supported in part by R01-AI095842 from NIH/NIAID to KM. Development of chitosan/siRNA-mediated gene silencing in A. aegypti20,21 was supported by NIH/NIAID Award R01-AI081795 to MDS. The contents of this study are solely the responsibility of the authors and do not necessarily represent the official views of the NIH.
Materials
| Name of Reagent/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Descriptions |
| 0.02 ml pipetteman | Rainin | PR20 | for resuspension of interfering RNA |
| 0.2 ml pipetteman | Rainin | PR200 | for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| 0.5 ml graduated tube | Fischer Scientific | 05-408-120 | for aliquoting resuspended interfering RNA |
| 1 ml pipetteman | Rainin | PR1000 | for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| 1.5 ml graduated tube | Fischer Scientific | 05-408-046 | for preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| 1M Sodium Acetate, pH 4.5 | TEKnova | S0299 | to prepare sodium acetate buffer |
| Acetic Acid, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grade | BDH | VWR BDH3092-500MLP | to prepare sodium acetate buffer |
| Agarose Genetic Technology Grade | MP Biomedicals LLC. | 800668 | to coat prepared interfering RNA/nanoparticles |
| Centrifuge | Eppendorf AG | 5415D | to pellet interfering RNA/nanoparticles |
| Chitosan, from shrimp shells | Sigma-Aldrich | C3646-25G | to combine with interfering RNA for prepararation of interfering RNA/nanoparticles |
| Dry Yeast | Universal Food Corp | NA | to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles |
| E-RNAi tool | German Cancer Research Center | NA | for design of dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3// |
| goldfish food | Wardley | Goldfish FLAKE FOOD | to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles |
| Heated water bath | Thermo Scientific | 51221048 | to heat the interfering RNA/nanoparticles at 55oC |
| Ice | not applicable | not applicable | for thawing interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| Ice bucket | Fisher Scientific | 02-591-44 | for storage of ice used during the procedure |
| liver powder | MP Biomedicals LLC. | 900396 | to feed mosquito larvae post interfering RNA/nanoparticle treatment |
| Microwave oven | A variety of vendors | not applicable | to prepare 2% agarose solution |
| petridish (100X15 mm) | Fischer Scientific | 875713 | interfering RNA/nanoparticle feeding chamber for larvae |
| pH meter | Mettler Toledo | S220 | for preparation of buffers |
| Razor blade | Fischer Scientific | 12-640 | to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings |
| siRNA | Thermo Scientific/Dharmacon | custom | for preparation of siRNA/nanoparticles |
| Sodium Sulfate, Anhydrous (Na2SO4) | BDH/distributed by VWR | VWR BDH0302-500G | to prepare 50mM sodium sulfate solution in which the interfering RNA will be resuspended |
| Thermometer | VWR | 61066-046 | to measure the water bath temperature |
| Tooth picks | VWR | 470146-908 | for stirring during interfering RNA/nanoparticle food preparation and cutting gel pellets |
| Ultralow freezer | A variety of vendors | not applicable | for storage of interfering RNA aliquots and interfering RNA/nanoparticles at -80oC |
| Vortex mixer | Fischer Scientific | 02-216-108 | for preparation of chitosan/interfering RNA |
| Weight paper | Fischer Scientific | NC9798735 | to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings |
Riferimenti
- Knipling, E. F., et al. Genetic control of insects of public health importance. Bulletin of the World Health Organization. 38 (3), 421-438 (1968).
- Fu, G., et al. Female-specific flightless phenotype for mosquito control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (10), 4550-4554 (2010).
- Wise de Valdez, M. R., et al. Genetic elimination of dengue vector mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (12), 4772-4775 (2011).
- Harris, A. F., et al. Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes. Nature Biotechnology. 30 (9), 828-830 (2012).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Yu, N., et al. Delivery of dsRNA for RNAi in insects: an overview and future directions. Insect science. 20 (1), 4-14 (2013).
- Zhang, H., Li, H. C., Feasibility Miao, X. X. limitation and possible solutions of RNAi-based technology for insect pest control. Insect science. 20 (1), 15-30 (2013).
- Clemons, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Functional analysis of genes in Aedes aegypti embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).
- Clemons, A., et al. siRNA-mediated gene targeting in Aedes aegypti embryos reveals that frazzled regulates vector mosquito CNS development. PLoS One. 6 (1), e16730 (2011).
- Haugen, M., et al. Semaphorin-1a is required for Aedes aegypti embryonic nerve cord development. PLoS One. 6 (6), e21694 (2011).
- Nguyen, C., et al. Functional genetic characterization of salivary gland development in Aedes aegypti. EvoDevo. 4 (1), 9 (2013).
- Sarro, J., et al. Requirement for commissureless2 function during dipteran insect nerve cord development. Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 242 (12), 1466-1477 (2013).
- Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control. J Insect Sci. 13, 69 (2013).
- Lopez-Martinez, G., Meuti, M., Denlinger, D. L. Rehydration driven RNAi: a novel approach for effectively delivering dsRNA to mosquito larvae. Journal of medical entomology. 49 (1), 215-218 (2012).
- Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. Journal of insect physiology. 59 (12), 1212-1221 (2013).
- Coy, M. R., et al. Gene silencing in adult Aedes aegypti mosquitoes through oral delivery of double-stranded RNA. J Appl Entomol. 136 (10), 741-748 (2012).
- Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae). Insect molecular biology. 19 (5), 683-693 (2010).
- Mysore, K., Flannery, E. M., Tomchaney, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Disruption of Aedes aegypti olfactory system development through chitosan/siRNA nanoparticle targeting of semaphorin-1a. PLoS neglected tropical diseases. 7 (5), e2215 (2013).
- Mysore, K., Andrews, E., Li, P., Duman-Scheel, M. Chitosan/siRNA nanoparticle targeting demonstrates a requirement for single-minded during larval and pupal olfactory system development of the vector mosquito Aedes aegypti. BMC developmental biology. 14 (1), 9 (2014).
- Dass, C. R., Choong, P. F. Chitosan-mediated orally delivered nucleic acids: a gutful of gene therapy. Journal of drug targeting. 16 (4), 257-261 (2008).
- An, C., Budd, A., Kanost, M. R., Michel, K. Characterization of a regulatory unit that controls melanization and affects longevity of mosquitoes. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 68 (11), 1929-1939 (2011).
- Clemons, A., Mori, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Culturing and egg collection of Aedes aegypti. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).
- Horn, T., Boutros, M. E-RNAi: a web application for the multi-species design of RNAi reagents–2010 update. Nucleic acids research. 38, W332-W339 (2010).
- Patel, N. H., PA, K. r. i. e. g. Ch. 19. In situ hybridization to whole mount Drosophila embryos. A laboratory guide to RNA: Isolation, Analysis, and Synthesis. , (1996).
- Haugen, M., et al. . Whole-mount in situ hybridization for analysis of gene expression during Aedes aegypti development. 2010 (10), (2010).
- Clemons, A., Flannery, E., Kast, K., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Immunohistochemical analysis of protein expression during Aedes aegypti development. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (1101).
- Rund, S. S., Hou, T. Y., Ward, S. M., Collins, F. H., Duffield, G. E. Genome-wide profiling of diel and circadian gene expression in the malaria vector Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (32), E421-E430 (2011).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
- Aryan, A., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Targeted genome editing in Aedes aegypti using TALENs. Methods. 69 (1), 38-45 (2014).
- Sarathi, M., Simon, M. C., Venkatesan, C., Hameed, A. S. Oral administration of bacterially expressed VP28dsRNA to protect Penaeus monodon from white spot syndrome virus. Mar Biotechnol (NY). 10 (3), 242-249 (2008).
- He, B., et al. Fluorescent nanoparticle delivered dsRNA toward genetic control of insect pests). Adv Mater. 25 (33), 4580-4584 (2013).
- Giljohann, D. A., Seferos, D. S., Prigodich, A. E., Patel, P. C., Mirkin, C. A. Gene regulation with polyvalent siRNA-nanoparticle conjugates. Journal of the American Chemical Society. 131 (6), 2072-2073 (2009).
- Davis, M. E., et al. Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature. 464 (7921), 1067-1070 (2010).
- Molinaro, R., et al. Polyethylenimine and chitosan carriers for the delivery of RNA interference effectors. Expert opinion on drug delivery. 10 (12), 1653-1668 (2013).
- Singha, K., et al. Polymers in small-interfering RNA delivery. Nucleic acid therapeutics. 21 (3), 133-148 (2011).
