Хитозан / интерферирующих РНК наночастиц опосредованного молчания генов в развитии болезни Векторный личинки комаров
Summary
Здесь мы описываем процедуру для ингибирования функции генов в вектор болезнь комаров посредством использования хитозана / интерферирующих РНК наночастиц, которые проглатывании личинками.
Abstract
Комарами-переносчиками нанести больший человеческие страдания, чем любой другой организм, – и убивают более одного миллиона человек каждый год. Комар генома проекты способствовали развитию исследований в новых гранях комаров биологии, в том числе функциональных генетических исследований на первичном африканского вектора малярии Anopheles gambiae и денге и желтая вектора лихорадка Комар желтолихорадочный. РНК РАДИОПОМЕХ (RNAi-) опосредованного молчание генов была использована для генов-мишеней, представляющих интерес в обоих этих переносчиков болезней видов комаров. Здесь мы опишем процедуру подготовки хитозана / интерферирующих РНК наночастиц, которые в сочетании с пищей и попадает в организм личинок. Это технически прост, высокая пропускная способность и относительно недорогой методики, который совместим с длинной двухцепочечной РНК (дцРНК) или малых интерферирующих РНК (киРНК) молекул, была использована для успешного нокдауна ряда различных генов в A. gambiae и А. AegyptiЛичинки. После личинок кормления, нокдаун, который проверяется с помощью Qrt-PCR или гибридизация, могут сохраняться по крайней мере до конца стадии куколки. Эта методика может быть применимо к широкому разнообразию комаров и других видов насекомых, в том числе вредителей сельского хозяйства, а также других не-модельных организмов. В дополнение к его полезности в научно-исследовательской лаборатории, в будущем, хитозан, недорогой, нетоксичного и биоразлагаемого полимера, потенциально может быть использована в поле.
Introduction
Кровь векторные кормления комаров родов малярийного и Aedine передачи болезнетворных агентов, ответственных за некоторые из худших бедствий человечества. По оценкам, 3,4 млрд человек находятся под угрозой заражения малярией, которая отвечает за более половины миллиона случаев смерти в год по всему миру. Результаты борьбы с малярией от инфекции Plasmodium Sp. Паразиты, которые передаются людям через укусы инфицированных комаров рода Anopheles, в том числе основной африканского вектора Anopheles gambiae ( http://www.who.int/topics/malaria/en/ , 2014) 1. Комар желтолихорадочный является основным вектором комаров для вируса денге, которая вызывает лихорадку денге, неспецифический лихорадочного заболевания, которое наиболее широко распространенным и значимым arboviral заболеванием в мире. Вирус денге в настоящее время угроза> 2,5 миллиарда человек в тропиках, с годовой incidenCE примерно 50 миллионов случаев, в результате ~ 24000 смертей в год ( http://www.cdc.gov/dengue/ , 2014) 2. Несмотря на разрушительное глобальное воздействие комарами заболеваний на здоровье человека, эффективные средства профилактики и лечения этих заболеваний не хватает. Борьба с комарами в настоящее время лучший способ профилактики заболеваний.
Потенциал для борьбы с членистоногими заболеваний, передающихся от генетического манипулирования векторных насекомых была признана на протяжении более четырех десятилетий 3. Трансгенные штаммы A. Aegypti инженерии, чтобы иметь репрессируемый женский конкретных фенотип нелетающих недавно сделали потенциал для использования трансгенных стратегий борьбы с переносчиками реальность 4-6. Эти достижения были оспорены исследователям в выявлении новых генетических задач по борьбе с переносчиками и дополнительных средств манипулирования функции гена в вектор комаров. Изменение экспрессии генов Dразвитие тором, как это было в случае с женщинами нелетающих комаров 4, может способствовать выяснению новых стратегий по борьбе с переносчиками. Тем не менее, в значительной степени из-за технических проблем, функции немногих генов, были охарактеризованы в процессе развития А. gambiae, А. Aegypti, или другие виды комаров.
С момента своего открытия в С. Elegans 7, РНК-интерференция (RNAi), которая сохраняется у животных, растений и микроорганизмов, широко используется для функциональных генетических исследований в самых разнообразных организмов, в том числе насекомых 8,9. РНК-интерференция путь инициируется Dicer, который расщепляет долгое дсРНК в короткие 20-25 нуклеотидных длиной миРНК, которые функционируют как последовательности конкретных интерферирующих РНК. siРНК, гены тишина, которые дополняют друг друга в последовательности, способствующие ускорению транскриптов, декольте, и нарушение перевод 9. Длинные молекулы дцРНК (обычно 300-600 б.п.) или пользовательские миРНК, направленные на particulaг последовательность может быть использована в научно-исследовательской лаборатории по глушителей любой интересующий ген. Управляя когда интерферирующих РНК доставлен, исследователи могут контролировать время, в которое ген глушителей посвященных. Это преимущество полезен, поскольку он может быть использован для преодоления проблем, таких как летальность развития или бесплодие, которые могут препятствовать производство и техническое обслуживание штаммов, несущих наследственные мутации, дорогой и трудоемкий процесс, который пока не имеется у всех видов насекомых. Хотя степень молчания генов путем РНК-интерференции может варьироваться от гена с геном, ткани к ткани, и животного к животному, RNAi широко используется для функционального анализа генов в комаров и других насекомых 8,9.
Три препятствующие стратегии доставки РНК были использованы в комаров: микроинъекции, впитывая / местного применения и приема внутрь. Для подробной истории и сравнения с использованием этих трех методов в насекомых, пожалуйста, обратитесь к Ю. и др 8. Wе успешно использовали микроинъекции 10 в качестве средства доставки миРНК целевой гены развития в А. Aegypti эмбрионы, личинки, куколки, так и 11-14. Тем не менее, это трудоемкий стратегия доставка требует и настройки микроинъекции и искусной рукой. Кроме того, микроинъекции это стресс для организма, сбивающий фактор, особенно когда поведенческие фенотипы будут оценены. Наконец, поставка микроинъекции не может быть расширено до поля для борьбы с переносчиками. В качестве альтернативы, замачивания в организм интерферирующих РНК решение также стало популярным средством индукции молчание генов, как это удобно и не требует большого оборудования или труда. Замачивание уже в основном применяются в клеточной линии насекомых изучает 8, но в недавнем исследовании, нокдаун был достигнут в А. Aegypti личинки погружают в раствор дцРНК 15, который животные, казалось, глотания. Тем не менее, для исследований, анализ нескольких experimentaл группы или фенотипы, замачивание, а дорого. Лопес-Мартинес и др. 16 описано регидратации приводом RNAi, новый подход к вмешательства доставку РНК, которая включает обезвоживание в солевом растворе и регидратации с одной капли воды, содержащей интерферирующих РНК. Такой подход не сократить затраты, связанные с целого животного погружения, но дороже, чем микроинъекции и может быть ограничено в своем применении к видам, которые могут выдерживать высокие осмотические давления. Кроме того, трудно представить себе, как погружение, или дегидратации / регидратации методики погружения может быть приспособлен для борьбы с переносчиками в этой области. По этим причинам, для пост-эмбриональных исследований, доставка интерферирующих РНК с проглоченной пищи жизнеспособной альтернативой стратегии.
Хотя стратегии приеме внутрь на основе не работать во всех видов насекомых, пожалуй, самое частности дрозофилы, оральный доставка интерферирующих РНК, смешанный с пищей способствовало гена сиlencing в различных насекомых 8,17, в том числе А. Aegypti взрослых 18. Мы описали хитозана наночастиц опосредованного RNAi в А. gambiae личинки 19 и успешно применил этот подход к снижению экспрессии генов в A. Aegypti личинки 20,21. Здесь методика этой процедуры RNAi, который включает в себя улавливания из интерферирующих РНК в полимерной хитозана, подробно. Хитозан / помехи наночастицы РНК образуются путем самосборки поликатионов с интерферирующих РНК с помощью электростатических сил между положительными зарядами аминогрупп в хитозана и отрицательных зарядов, переносимых фосфатных групп от основной цепи интерферирующих РНК 19. Процедура, описанная совместим с длинных молекул дцРНК (далее именуемые дсРНК) или двухцепочечной Серна (далее по тексту миРНК). После синтеза хитозан / помехи наночастицы РНК смешивали с пищей личинок и доставленЛичинки при приеме внутрь. Эта методика является относительно недорогим, не требует большого труда и оборудование 19, и способствует высокой пропускной анализ нескольких фенотипов, в том числе анализа поведения 20,21. Эта методика, которая может быть адаптирована для молчания генов исследований в других насекомых, в том числе других переносчиков болезней и насекомых вредителей сельского хозяйства, потенциально могут быть использованы для молчания генов в различных других видов животных. Кроме того, хитозан, недорогой, нетоксичный и биоразлагаемый полимер 22, потенциально могут быть использованы в области для конкретных видов борьбы с комарами.
Protocol
Representative Results
Discussion
Хитозан / вмешательства РНК методики описаны здесь в виде наночастиц был использован эффективно генов-мишеней при развитие личинок в А. gambiae (рис 2, 3) и А. Aegypti (рис 4, 5, 6, Столы 1, 2). Хитозан наночастицы могут быть получены либо с длинной дцРНК или миРНК, оба из кот?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding from the Kansas Agricultural Experiment Station and K-State Arthropod Genomics Center to KYZ supported the original development of chitosan/dsRNA-mediated gene silencing in A. gambiae19.The A. gambiae work described here was supported in part by R01-AI095842 from NIH/NIAID to KM. Development of chitosan/siRNA-mediated gene silencing in A. aegypti20,21 was supported by NIH/NIAID Award R01-AI081795 to MDS. The contents of this study are solely the responsibility of the authors and do not necessarily represent the official views of the NIH.
Materials
| Name of Reagent/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Descriptions |
| 0.02 ml pipetteman | Rainin | PR20 | for resuspension of interfering RNA |
| 0.2 ml pipetteman | Rainin | PR200 | for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| 0.5 ml graduated tube | Fischer Scientific | 05-408-120 | for aliquoting resuspended interfering RNA |
| 1 ml pipetteman | Rainin | PR1000 | for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| 1.5 ml graduated tube | Fischer Scientific | 05-408-046 | for preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| 1M Sodium Acetate, pH 4.5 | TEKnova | S0299 | to prepare sodium acetate buffer |
| Acetic Acid, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grade | BDH | VWR BDH3092-500MLP | to prepare sodium acetate buffer |
| Agarose Genetic Technology Grade | MP Biomedicals LLC. | 800668 | to coat prepared interfering RNA/nanoparticles |
| Centrifuge | Eppendorf AG | 5415D | to pellet interfering RNA/nanoparticles |
| Chitosan, from shrimp shells | Sigma-Aldrich | C3646-25G | to combine with interfering RNA for prepararation of interfering RNA/nanoparticles |
| Dry Yeast | Universal Food Corp | NA | to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles |
| E-RNAi tool | German Cancer Research Center | NA | for design of dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3// |
| goldfish food | Wardley | Goldfish FLAKE FOOD | to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles |
| Heated water bath | Thermo Scientific | 51221048 | to heat the interfering RNA/nanoparticles at 55oC |
| Ice | not applicable | not applicable | for thawing interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| Ice bucket | Fisher Scientific | 02-591-44 | for storage of ice used during the procedure |
| liver powder | MP Biomedicals LLC. | 900396 | to feed mosquito larvae post interfering RNA/nanoparticle treatment |
| Microwave oven | A variety of vendors | not applicable | to prepare 2% agarose solution |
| petridish (100X15 mm) | Fischer Scientific | 875713 | interfering RNA/nanoparticle feeding chamber for larvae |
| pH meter | Mettler Toledo | S220 | for preparation of buffers |
| Razor blade | Fischer Scientific | 12-640 | to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings |
| siRNA | Thermo Scientific/Dharmacon | custom | for preparation of siRNA/nanoparticles |
| Sodium Sulfate, Anhydrous (Na2SO4) | BDH/distributed by VWR | VWR BDH0302-500G | to prepare 50mM sodium sulfate solution in which the interfering RNA will be resuspended |
| Thermometer | VWR | 61066-046 | to measure the water bath temperature |
| Tooth picks | VWR | 470146-908 | for stirring during interfering RNA/nanoparticle food preparation and cutting gel pellets |
| Ultralow freezer | A variety of vendors | not applicable | for storage of interfering RNA aliquots and interfering RNA/nanoparticles at -80oC |
| Vortex mixer | Fischer Scientific | 02-216-108 | for preparation of chitosan/interfering RNA |
| Weight paper | Fischer Scientific | NC9798735 | to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings |
Riferimenti
- Knipling, E. F., et al. Genetic control of insects of public health importance. Bulletin of the World Health Organization. 38 (3), 421-438 (1968).
- Fu, G., et al. Female-specific flightless phenotype for mosquito control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (10), 4550-4554 (2010).
- Wise de Valdez, M. R., et al. Genetic elimination of dengue vector mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (12), 4772-4775 (2011).
- Harris, A. F., et al. Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes. Nature Biotechnology. 30 (9), 828-830 (2012).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Yu, N., et al. Delivery of dsRNA for RNAi in insects: an overview and future directions. Insect science. 20 (1), 4-14 (2013).
- Zhang, H., Li, H. C., Feasibility Miao, X. X. limitation and possible solutions of RNAi-based technology for insect pest control. Insect science. 20 (1), 15-30 (2013).
- Clemons, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Functional analysis of genes in Aedes aegypti embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).
- Clemons, A., et al. siRNA-mediated gene targeting in Aedes aegypti embryos reveals that frazzled regulates vector mosquito CNS development. PLoS One. 6 (1), e16730 (2011).
- Haugen, M., et al. Semaphorin-1a is required for Aedes aegypti embryonic nerve cord development. PLoS One. 6 (6), e21694 (2011).
- Nguyen, C., et al. Functional genetic characterization of salivary gland development in Aedes aegypti. EvoDevo. 4 (1), 9 (2013).
- Sarro, J., et al. Requirement for commissureless2 function during dipteran insect nerve cord development. Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 242 (12), 1466-1477 (2013).
- Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control. J Insect Sci. 13, 69 (2013).
- Lopez-Martinez, G., Meuti, M., Denlinger, D. L. Rehydration driven RNAi: a novel approach for effectively delivering dsRNA to mosquito larvae. Journal of medical entomology. 49 (1), 215-218 (2012).
- Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. Journal of insect physiology. 59 (12), 1212-1221 (2013).
- Coy, M. R., et al. Gene silencing in adult Aedes aegypti mosquitoes through oral delivery of double-stranded RNA. J Appl Entomol. 136 (10), 741-748 (2012).
- Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae). Insect molecular biology. 19 (5), 683-693 (2010).
- Mysore, K., Flannery, E. M., Tomchaney, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Disruption of Aedes aegypti olfactory system development through chitosan/siRNA nanoparticle targeting of semaphorin-1a. PLoS neglected tropical diseases. 7 (5), e2215 (2013).
- Mysore, K., Andrews, E., Li, P., Duman-Scheel, M. Chitosan/siRNA nanoparticle targeting demonstrates a requirement for single-minded during larval and pupal olfactory system development of the vector mosquito Aedes aegypti. BMC developmental biology. 14 (1), 9 (2014).
- Dass, C. R., Choong, P. F. Chitosan-mediated orally delivered nucleic acids: a gutful of gene therapy. Journal of drug targeting. 16 (4), 257-261 (2008).
- An, C., Budd, A., Kanost, M. R., Michel, K. Characterization of a regulatory unit that controls melanization and affects longevity of mosquitoes. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 68 (11), 1929-1939 (2011).
- Clemons, A., Mori, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Culturing and egg collection of Aedes aegypti. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).
- Horn, T., Boutros, M. E-RNAi: a web application for the multi-species design of RNAi reagents–2010 update. Nucleic acids research. 38, W332-W339 (2010).
- Patel, N. H., PA, K. r. i. e. g. Ch. 19. In situ hybridization to whole mount Drosophila embryos. A laboratory guide to RNA: Isolation, Analysis, and Synthesis. , (1996).
- Haugen, M., et al. . Whole-mount in situ hybridization for analysis of gene expression during Aedes aegypti development. 2010 (10), (2010).
- Clemons, A., Flannery, E., Kast, K., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Immunohistochemical analysis of protein expression during Aedes aegypti development. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (1101).
- Rund, S. S., Hou, T. Y., Ward, S. M., Collins, F. H., Duffield, G. E. Genome-wide profiling of diel and circadian gene expression in the malaria vector Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (32), E421-E430 (2011).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
- Aryan, A., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Targeted genome editing in Aedes aegypti using TALENs. Methods. 69 (1), 38-45 (2014).
- Sarathi, M., Simon, M. C., Venkatesan, C., Hameed, A. S. Oral administration of bacterially expressed VP28dsRNA to protect Penaeus monodon from white spot syndrome virus. Mar Biotechnol (NY). 10 (3), 242-249 (2008).
- He, B., et al. Fluorescent nanoparticle delivered dsRNA toward genetic control of insect pests). Adv Mater. 25 (33), 4580-4584 (2013).
- Giljohann, D. A., Seferos, D. S., Prigodich, A. E., Patel, P. C., Mirkin, C. A. Gene regulation with polyvalent siRNA-nanoparticle conjugates. Journal of the American Chemical Society. 131 (6), 2072-2073 (2009).
- Davis, M. E., et al. Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature. 464 (7921), 1067-1070 (2010).
- Molinaro, R., et al. Polyethylenimine and chitosan carriers for the delivery of RNA interference effectors. Expert opinion on drug delivery. 10 (12), 1653-1668 (2013).
- Singha, K., et al. Polymers in small-interfering RNA delivery. Nucleic acid therapeutics. 21 (3), 133-148 (2011).
