Hastalık Vektör Sivrisinek Larva içinde Kitosan / Müdahale RNA Nanopartikül Aracılı gen susturma
Summary
Burada larvaları tarafından sindirilen RNA nano-tanecikleri / kitosan kullanımı yoluyla hastalık taşıyıcıları sivrisinek gen fonksiyonunun inhibe edilmesine müdahale için bir prosedür tarif eder.
Abstract
Vektör Sivrisinek başka bir organizma daha çok insan acı indirebilmek – ve bir milyondan fazla insanı her yıl öldürmek. Sivrisinek genom projeleri birincil Afrika sıtma vektörü Anopheles gambiae ve dang ve sarı humma vektör Aedes aegypti fonksiyonel genetik çalışmalar da dahil olmak üzere sivrisinek biyoloji yeni yönleriyle, araştırma kolaylaştırdı. RNA parazitsiz (RNAi-) aracılık ettiği gen susması, bu hastalık taşıyıcıları sivrisinek türlerinin her ikisi de ilgi genleri hedef olarak kullanılmaktadır. Burada, gıda ile birlikte ve larvaları tarafından sindirilen RNA nano-tanecikleri müdahale / çitosan hazırlanması için bir prosedür tarif eder. Uzun çift kollu RNA (dsRNA), ya da küçük müdahale edici RNA (siRNA) molekülleri ile uyumlu olan bu teknik basit, yüksek hacimli, ve nispeten pahalı olmayan bir yöntem, A. farklı geninin başarılı bir şekilde demonte kullanılmaktadır gambiae ve A. aegyptiMah-PCR ile veya in situ hibridizasyon doğrulandı larva. larva beslenmeye ardından, demonte, en azından geç pupa aşamasından devam edebilirsiniz. Bu yöntem, bir sivrisinek ve tarımsal zararlıların da dahil olmak üzere diğer böcek türleri, çok çeşitli, hem de diğer olmayan modeli organizmalar için de geçerli olabilir. Araştırma laboratuarında de yararlı ek olarak, gelecekte, çitosan, ucuz, toksik olmayan ve biyolojik olarak parçalanabilir bir polimer içinde, potansiyel alanında kullanılabilir.
Introduction
Anopheline türü ve aedine cins Kan besleme vektör sivrisinek insanlığın en kötü bela birkaç sorumlu hastalığa neden olan ajanlar iletir. Tahminen 3,4 milyar insan yılda dünya çapında üzerinden bir buçuk milyon kişinin ölümünden sorumlu olan sıtma, sözleşme için risk altındadır. Plasmodium sp enfeksiyonundan Sıtma sonuçları. Başlıca Afrika vektörü Anopheles gambiae (dahil Anopheles cinsi sivrisineklerin enfekte, ısırıkları ile insanlara iletilir parazitler, http://www.who.int/topics/malaria/en/ , 2014) 1. Aedes aegypti dang ateşi, dünyanın en yaygın ve önemli arboviral hastalıktır nonspesifik ateşli hastalığa neden dang virüsü, birincil sivrisinek vektör. Dang virüsü yıllık inciden ile, halen tropik> 2,5 milyar kişiye bir tehdittir24.000 ölüm yıl ~ sonuçlanan yaklaşık 50 milyon olgunun ce ( http://www.cdc.gov/dengue/ , 2014) 2. Insan sağlığı üzerindeki sivrisinek yoluyla bulaşan hastalıkların yıkıcı küresel etkilerine rağmen, önlenmesi ve bu hastalıkların tedavisinde etkili aracı eksiktir. Sivrisinek kontrolü halen hastalığın önlenmesi en iyi yöntemdir.
Vektör böceklerin genetik manipülasyon yoluyla Artropod kaynaklı hastalıkların kontrolü için potansiyeli dört yılı aşkın bir süredir 3 için kabul edilmiştir. A. Transgenik soylar Son zamanlarda transgenik vektör kontrol stratejileri gerçeğe 4-6 kullanarak potansiyelini yaptık aegypti bir bastırılabilir kadın-özel uçamayan fenotip sahip tasarlanmış. Bu gelişmeler vektör kontrolü ve vektör sivrisinek gen fonksiyonunu manipüle ek araçları için yeni genetik hedefler belirlemek için araştırmacılar meydan var. Gen ifadesi d Tadilatınakadın-uçamayan sivrisinekler 4 yılında olduğu gibi uring geliştirme, yeni vektör kontrol stratejilerinin açıklanmasını teşvik edebilir. Ancak, büyük ölçüde teknik zorluklar, çok az genlerin fonksiyonları A. geliştirilmesi sırasında karakterize edilmiştir gambiae, A. aegypti veya diğer sivrisinek türleridir.
C yılında keşfedilmesinden bu yana elegans 7, hayvanlar, bitkiler ve mikroorganizmalar muhafaza edilir, RNA interferans (RNAi), yaygın olarak böcekler 8,9 dahil olmak üzere, geniş bir organizma, çeşitli işlevsel genetik çalışmalar için kullanılmıştır. RNAi yolu diziye özgü müdahale RNA olarak işlev kısa 20-25 nükleotid uzunluğundaki siRNA'lar içine Dicer bölünen uzun dsRNA ile başlatılır. transkript ciro, bölünme ve çeviri 9 bozulması teşvik ederek sırayla tamamlayıcı siRNA'lar sessizlik genler. Bir Particula hedefleme uzun dsRNA molekülleri (tipik olarak 300-600 bp) ya da özel siRNA'larR dizisi, ilgi konusu herhangi bir gen susturma araştırma laboratuarda kullanılabilir. RNA teslim edilir müdahale sırasında yöneterek, araştırmacılar hangi gen de inisiyelere susturulması zaman kontrol edebilirsiniz. Bu üretim ve kalıtsal mutasyonlar, henüz tüm böcek türlerinin mevcut değildir pahalı ve emek-yoğun bir süreç taşıyan suşların bakım engelleyebilir gibi gelişimsel öldürücülüğü veya kısırlık gibi zorlukların üstesinden gelmek için kullanılabildiği gibi bu avantaj yararlıdır. RNAi, gen susturma derecesi hayvana geni, dokuya doku ve hayvan geninin arasında değişebilir, ancak, RNAi yaygın sivrisinek ve diğer böcekler 8,9 genlerin işlevsel analiz için kullanılmaktadır.
Üç müdahale RNA teslim stratejileri sivrisinekler kullanılmıştır: mikroenjeksiyon, iliklerine / topikal uygulama, ve yenmesi. Detaylı bir tarih ve böcekler bu üç teknikler kullanılarak Karşılaştırma için, Yu ve arkadaşları 8 bakınız. WE başarılı bir şekilde A. gelişim hedef genlere siRNA'lar vermek için bir araç olarak mikroenjeksiyon 10 kullandık aegypti embriyolar, larva, pupa ve 11-14. Ancak, bu emek-yoğun teslimat strateji mikroenjeksiyon kurulum ve yetenekli bir el hem de gerektirir. Ayrıca, mikroenjeksiyon davranışsal fenotipleri değerlendirilecek, özellikle organizma, bir karıştırıcı faktör streslidir. Son olarak, mikro-enjeksiyon aktarım vektörü kontrol alanına uzatılamaz. Bu uygundur ve küçük ekipman veya emek gerektirir bir alternatif olarak, RNA çözümü müdahale organizmayı iliklerine de, gen susturulması tetikleme popüler bir araç haline gelmiştir. Islatma öncelikle böcek hücre hattında uygulanmaktadır 8 çalışmaları, ancak son çalışmada, Knockdown A'da elde edildi aegypti larva hayvanlar sindirerek ortaya çıktı dsRNA 15, ihtiva eden bir çözeltiye batırılır. Bununla birlikte, birden fazla experimenta analizini kapsayan çalışmalar içinL grubu veya fenotipleri, ıslatma oldukça maliyetlidir. Lopez-Martinez ve diğ. 16 RNAi, engelleyen RNA ihtiva eden tek bir su damlası ile tuzlu su çözeltisi ve rehidrasyon dehidratasyon içeren RNA teslim müdahale için yeni bir yaklaşım tahrik rehidrasyon tarif. Bu yaklaşım, tüm hayvan daldırma ile ilişkili maliyetlerini düşürmek, ancak mikroenjeksiyon daha pahalı ve yüksek ozmotik basınçları tolere edebilir türlere uygulanması sınırlı edilebilir değildir. Ayrıca, daldırma ya da dehidrasyon / rehidrasyon daldırma yöntemi alanında vektör kontrolü için uyarlanabilir nasıl tasavvur etmek zordur. Bu nedenlerden dolayı, post-embriyonik çalışmalar için alınan gıda ile müdahaleci RNA teslim uygun bir alternatif bir stratejidir.
Yenmesi-tabanlı stratejiler, tüm böcek türleri, belki de en önemlisi Drosophila melanogaster çalışmıyor rağmen, gıda ile karışık RNA müdahale oral teslim gen si terfi ettiBöceklerin 8,17 çeşitli lencing, aşağıdakileri içeren A. aegypti yetişkin 18. Bu A'da kitosan nanopartikül aracılı RNAi tarif gambiae larva 19 ve başarılı bir şekilde A. gen ekspresyonunun azaltılması için, bu yaklaşım uyguladık aegypti larvaları 20,21. Burada, polimer kitosan ile RNA müdahale sürüklenmemesine içerir bu RNAi prosedürü, metodolojisi, ayrıntılı. Kitosan / müdahale edici RNA nanopartiküller çitosan amino gruplarının pozitif yüklerin ve RNA 19 müdahale omurgasında fosfat grupları tarafından taşınan negatif yük arasındaki elektrostatik kuvvetler aracılığıyla müdahaleci RNA ile polikatyonlar kendini düzenlemesinden oluşur. açıklanan prosedür uzun dsRNA moleküllerinin (bundan sonra siRNA olarak anılacaktır) siRNA şeritli (bundan sonra dsRNA olarak anılacaktır) ya da çift ile uyumludur. Aşağıdaki sentez, çitosan / müdahale edici RNA nanopartiküller Konukçu ile karıştırıldı ve teslim edilirOral yoldan alım yoluyla larva. Bu metodoloji, nispeten ucuz küçük ekipman ve emek gerektirir 19, ve davranışların 20,21 analizi de dahil olmak üzere çok sayıda fenotip, yüksek verimlilik analizini kolaylaştırır. Diğer hastalık vektörleri ve böcek tarım haşere de dahil olmak üzere diğer böcekler, gen susturma çalışmaları için adapte edilebilir Bu metodoloji, potansiyel olarak diğer hayvan türlerinin çeşitli gen susturma için kullanılabilir. Ayrıca, çitosan, ucuz, toksik olmayan ve biyolojik olarak parçalanabilir bir polimer 22, potansiyel olarak türe özgü sivrisinek kontrolü için alanda kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada tarif edilen çitosan / müdahale edici RNA nanopartikül yöntem etkili bir şekilde A. larva gelişimi sırasında hedef genlere kullanılmıştır gambiae (Şekil 2, 3) ve A. aegypti (Şekiller 4, 5, 6, Tablolar 1, 2). Kitosan nanopartiküller olarak burada tarif edilen sonuçları ile kanıtlandığı gibi, sivrisinek olarak başarılı bir şekilde kullanılmıştır, her ikisi de uzun dsRNA veya siRNA, ya da hazırlanabilir. DsRNA'nın Sentezi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding from the Kansas Agricultural Experiment Station and K-State Arthropod Genomics Center to KYZ supported the original development of chitosan/dsRNA-mediated gene silencing in A. gambiae19.The A. gambiae work described here was supported in part by R01-AI095842 from NIH/NIAID to KM. Development of chitosan/siRNA-mediated gene silencing in A. aegypti20,21 was supported by NIH/NIAID Award R01-AI081795 to MDS. The contents of this study are solely the responsibility of the authors and do not necessarily represent the official views of the NIH.
Materials
| Name of Reagent/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Descriptions |
| 0.02 ml pipetteman | Rainin | PR20 | for resuspension of interfering RNA |
| 0.2 ml pipetteman | Rainin | PR200 | for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| 0.5 ml graduated tube | Fischer Scientific | 05-408-120 | for aliquoting resuspended interfering RNA |
| 1 ml pipetteman | Rainin | PR1000 | for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| 1.5 ml graduated tube | Fischer Scientific | 05-408-046 | for preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| 1M Sodium Acetate, pH 4.5 | TEKnova | S0299 | to prepare sodium acetate buffer |
| Acetic Acid, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grade | BDH | VWR BDH3092-500MLP | to prepare sodium acetate buffer |
| Agarose Genetic Technology Grade | MP Biomedicals LLC. | 800668 | to coat prepared interfering RNA/nanoparticles |
| Centrifuge | Eppendorf AG | 5415D | to pellet interfering RNA/nanoparticles |
| Chitosan, from shrimp shells | Sigma-Aldrich | C3646-25G | to combine with interfering RNA for prepararation of interfering RNA/nanoparticles |
| Dry Yeast | Universal Food Corp | NA | to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles |
| E-RNAi tool | German Cancer Research Center | NA | for design of dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3// |
| goldfish food | Wardley | Goldfish FLAKE FOOD | to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles |
| Heated water bath | Thermo Scientific | 51221048 | to heat the interfering RNA/nanoparticles at 55oC |
| Ice | not applicable | not applicable | for thawing interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| Ice bucket | Fisher Scientific | 02-591-44 | for storage of ice used during the procedure |
| liver powder | MP Biomedicals LLC. | 900396 | to feed mosquito larvae post interfering RNA/nanoparticle treatment |
| Microwave oven | A variety of vendors | not applicable | to prepare 2% agarose solution |
| petridish (100X15 mm) | Fischer Scientific | 875713 | interfering RNA/nanoparticle feeding chamber for larvae |
| pH meter | Mettler Toledo | S220 | for preparation of buffers |
| Razor blade | Fischer Scientific | 12-640 | to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings |
| siRNA | Thermo Scientific/Dharmacon | custom | for preparation of siRNA/nanoparticles |
| Sodium Sulfate, Anhydrous (Na2SO4) | BDH/distributed by VWR | VWR BDH0302-500G | to prepare 50mM sodium sulfate solution in which the interfering RNA will be resuspended |
| Thermometer | VWR | 61066-046 | to measure the water bath temperature |
| Tooth picks | VWR | 470146-908 | for stirring during interfering RNA/nanoparticle food preparation and cutting gel pellets |
| Ultralow freezer | A variety of vendors | not applicable | for storage of interfering RNA aliquots and interfering RNA/nanoparticles at -80oC |
| Vortex mixer | Fischer Scientific | 02-216-108 | for preparation of chitosan/interfering RNA |
| Weight paper | Fischer Scientific | NC9798735 | to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings |
Riferimenti
- Knipling, E. F., et al. Genetic control of insects of public health importance. Bulletin of the World Health Organization. 38 (3), 421-438 (1968).
- Fu, G., et al. Female-specific flightless phenotype for mosquito control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (10), 4550-4554 (2010).
- Wise de Valdez, M. R., et al. Genetic elimination of dengue vector mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (12), 4772-4775 (2011).
- Harris, A. F., et al. Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes. Nature Biotechnology. 30 (9), 828-830 (2012).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Yu, N., et al. Delivery of dsRNA for RNAi in insects: an overview and future directions. Insect science. 20 (1), 4-14 (2013).
- Zhang, H., Li, H. C., Feasibility Miao, X. X. limitation and possible solutions of RNAi-based technology for insect pest control. Insect science. 20 (1), 15-30 (2013).
- Clemons, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Functional analysis of genes in Aedes aegypti embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).
- Clemons, A., et al. siRNA-mediated gene targeting in Aedes aegypti embryos reveals that frazzled regulates vector mosquito CNS development. PLoS One. 6 (1), e16730 (2011).
- Haugen, M., et al. Semaphorin-1a is required for Aedes aegypti embryonic nerve cord development. PLoS One. 6 (6), e21694 (2011).
- Nguyen, C., et al. Functional genetic characterization of salivary gland development in Aedes aegypti. EvoDevo. 4 (1), 9 (2013).
- Sarro, J., et al. Requirement for commissureless2 function during dipteran insect nerve cord development. Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 242 (12), 1466-1477 (2013).
- Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control. J Insect Sci. 13, 69 (2013).
- Lopez-Martinez, G., Meuti, M., Denlinger, D. L. Rehydration driven RNAi: a novel approach for effectively delivering dsRNA to mosquito larvae. Journal of medical entomology. 49 (1), 215-218 (2012).
- Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. Journal of insect physiology. 59 (12), 1212-1221 (2013).
- Coy, M. R., et al. Gene silencing in adult Aedes aegypti mosquitoes through oral delivery of double-stranded RNA. J Appl Entomol. 136 (10), 741-748 (2012).
- Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae). Insect molecular biology. 19 (5), 683-693 (2010).
- Mysore, K., Flannery, E. M., Tomchaney, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Disruption of Aedes aegypti olfactory system development through chitosan/siRNA nanoparticle targeting of semaphorin-1a. PLoS neglected tropical diseases. 7 (5), e2215 (2013).
- Mysore, K., Andrews, E., Li, P., Duman-Scheel, M. Chitosan/siRNA nanoparticle targeting demonstrates a requirement for single-minded during larval and pupal olfactory system development of the vector mosquito Aedes aegypti. BMC developmental biology. 14 (1), 9 (2014).
- Dass, C. R., Choong, P. F. Chitosan-mediated orally delivered nucleic acids: a gutful of gene therapy. Journal of drug targeting. 16 (4), 257-261 (2008).
- An, C., Budd, A., Kanost, M. R., Michel, K. Characterization of a regulatory unit that controls melanization and affects longevity of mosquitoes. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 68 (11), 1929-1939 (2011).
- Clemons, A., Mori, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Culturing and egg collection of Aedes aegypti. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).
- Horn, T., Boutros, M. E-RNAi: a web application for the multi-species design of RNAi reagents–2010 update. Nucleic acids research. 38, W332-W339 (2010).
- Patel, N. H., PA, K. r. i. e. g. Ch. 19. In situ hybridization to whole mount Drosophila embryos. A laboratory guide to RNA: Isolation, Analysis, and Synthesis. , (1996).
- Haugen, M., et al. . Whole-mount in situ hybridization for analysis of gene expression during Aedes aegypti development. 2010 (10), (2010).
- Clemons, A., Flannery, E., Kast, K., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Immunohistochemical analysis of protein expression during Aedes aegypti development. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (1101).
- Rund, S. S., Hou, T. Y., Ward, S. M., Collins, F. H., Duffield, G. E. Genome-wide profiling of diel and circadian gene expression in the malaria vector Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (32), E421-E430 (2011).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
- Aryan, A., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Targeted genome editing in Aedes aegypti using TALENs. Methods. 69 (1), 38-45 (2014).
- Sarathi, M., Simon, M. C., Venkatesan, C., Hameed, A. S. Oral administration of bacterially expressed VP28dsRNA to protect Penaeus monodon from white spot syndrome virus. Mar Biotechnol (NY). 10 (3), 242-249 (2008).
- He, B., et al. Fluorescent nanoparticle delivered dsRNA toward genetic control of insect pests). Adv Mater. 25 (33), 4580-4584 (2013).
- Giljohann, D. A., Seferos, D. S., Prigodich, A. E., Patel, P. C., Mirkin, C. A. Gene regulation with polyvalent siRNA-nanoparticle conjugates. Journal of the American Chemical Society. 131 (6), 2072-2073 (2009).
- Davis, M. E., et al. Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature. 464 (7921), 1067-1070 (2010).
- Molinaro, R., et al. Polyethylenimine and chitosan carriers for the delivery of RNA interference effectors. Expert opinion on drug delivery. 10 (12), 1653-1668 (2013).
- Singha, K., et al. Polymers in small-interfering RNA delivery. Nucleic acid therapeutics. 21 (3), 133-148 (2011).
