בידוד של תאי גידול במעי גס אנושיים ראשוניים מרקמות כירורגי וCulturing אותם ישירות על מצעים אלסטיים רכים לגרירה Cytometry
Summary
A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.
Abstract
תאים סרטניים להגיב למטריקס קשיחות מכאנית באופן מורכב באמצעות מערכת מתואמת, היררכית mechano-כימי מורכבות מקולטנים הידבקות וחלבוני קרום הולך האותות הקשורים, ארכיטקטורת cytoskeletal, ומנועים מולקולריים 1, 2. Mechanosensitivity של תאי סרטן שונים במבחנה הם חקר בעיקר עם קווים הנציחו תא או תאים ראשוניים בעכברים נגזרים, לא עם תאי סרטן אנושיים ראשוניים. לפיכך, מעט מאוד ידוע על mechanosensitivity של תאי סרטן המעי הגס אנושיים ראשוניים במבחנה. כאן, פרוטוקול מותאם מפותח המתאר את הבידוד של תאי מעי גס אנושיים ראשוניים מדגימות אנושיות כירורגית בריאה וסרטניות ברקמה. תאי מעי גס מבודדים אז הם מתורבתים בהצלחה על רך (2 kPa נוקשות) ונוקשה (10 kPa נוקשות) הידרוג polyacrylamide וקלקר קשיח (~ 3.6-GPA נוקשות) מצעים פונקציונליות על ידי מטריקס (פיברונקטיןבמקרה הזה). microbeads פלורסנט מוטבע בג'לי רך ליד משטח תרבית תאים, וassay המתיחה מבוצע על מנת להעריך לחצי התכווצות סלולריים באמצעות תוכנת גישה פתוחה בחינם. בנוסף, מיקרוסקופיה immunofluorescence על מצעי קשיחות שונים מספקת מידע שימושי על מורפולוגיה העיקרית תא, ארגון שלד התא וvinculin מכילה הידבקויות מוקד כפונקציה של קשיחות מצע.
Introduction
בשנים האחרונות זה הפך להיות ברור יותר ויותר כי מיקרו-סביבה מכאנית, בנוסף לגורמים ביו-כימיים, ממלא תפקיד חשוב בויסות פונקציות תא. תאים יכולים לחוש ולהגיב לקשיחות המצע שעליו הם דבקים (כמו בתרבות 2D) או מוקפת ב( כמו בתרבות 3D) 3-7. בעשותם כך, תאים יכולים לווסת בידולם 3, מורפולוגיה 4, הגירה / תנועתיות 5, נכסים ביו-פיזי 6, צמיחת 7, ותהליכים אחרים.
תאים סרטניים גם להגיב למטריצת קשיחות 2D and 3D באמצעות שילוב מתואם, היררכי mechano-כימי של קולטני הידבקות וחלבוני קרום הולך האותות הקשורים, ארכיטקטורת cytoskeletal, ומנועים מולקולריים 1, 2. לדוגמא, תאי אפיתל החלב (MECs) טופס parenchyma acinar הנורמלי כאשר בתרבית על 150 מצעי אבא שדומה לנוקשותשל רקמת שד בריאה. מעניין לציין, הם מפגינים סימני ההיכר של גידול מתפתח, גם מבני ותעתיק, כאשר בתרבית על מצעים נוקשה (> 5000 אבא) המחקים את הנוקשות של סטרומה גידול 8. בנוסף, ניסוי נוסף מראה כי tumorigenesis השד מלווה בcrosslinking קולגן וECM התקשות 9. ניסויים שנעשו לאחרונה מראים כי קרצינומה מעי גס אנושית (HCT-8) תאים להציג גרורות כמו פנוטיפ (MLP) כאשר הם בתרבית על מצעי 2D שיש נוקשות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית (20-47 kPa), אבל לא על נוקשה מאוד (3.6 GPA) מצעים 10 12 .These תאי צבירי תאים כמו גידול בצורה הראשונה ולאחר מכן לנתק את זה מזה, החל מהפריפריה. כאפיתל זה למעוגל מורפולוגיים (E למעבר R) שינוי מתרחש, הם מתרבים, להפחית תאי תאים והידבקות התא-ECM, והפכו נודד. HCT-8 תאים בתרבית על מצעי קלקר מאוד קשים אינו מציגים אלהתכונות ממאירות. כך זה כבר שיערו כי HCT-8 התאים להפוך לגרורתי בשל חשיפתם למייקרו-הסביבה מתאימה. ראוי לציין שניסויים אלה מבוצעים עם קווים הנציחו תא סרטני או תאים ראשוניים בעכברים נגזרים, לא עם תאי סרטן אנושיים ראשוניים.
מחקר שנערך לאחרונה מציע כי לחץ מתיחה סלולארי Augmented עשוי לשמש כחתימת biophysical פוטנציאל לתאים גרורתי 13 מחקר .the כרוך מדידת כוח מתיחה לשורות תאי הסרטן אנושיות שונות על ג'ל polyacrylamide. הוא מצא כי תאי סרטן גרורתי יכולים להפעיל לחץ מתיחה גבוה יותר באופן משמעותי בהשוואה לתאים שאינם גרורתי בכל המקרים 13. עם זאת, תוצאות אלה ישירות בסתירה לממצאים שפורסמו קודם לכן בשורות תאי סרטן השד בעכברים נגזרו 14. כמו כן, מחקר שנערך לאחרונה מדגיש הבדלים ראויים לציון בין תאים אנושיים הנציחו והעיקריים בפרו שיפוץ cytoskeletalפרופיל חלבון והביטוי חלבון הישרדות תא 15. לפיכך, חשוב לבקר רב של מבחני biophysical כוללים מתיחה לתאי סרטן אנושיים ראשוניים. זה יעסוק בשאלה אם התאים הראשוניים לשחזר מגמת מתיחת שורות תאי הסרטן הונצחה.
הפרוטוקול המתואר כאן הוא מותאם לבידוד של תאים ראשוניים אדם מעי גס (גם בריאים וסרטניים), ועבור culturing על מצעים רכים (הידרוג polyacrylamide), כמו גם על צלחות פטרי. הפרוטוקול מבוסס על מערכת עיכול ודיסוציאציה האנזימטית הסוגר של דגימת רקמה כירורגית לתוך תא בודד השעיה 16. למיטב ידיעתנו, זה הוא ההפגנה הראשונה של culturing גידול במעי הגס ראשוני מבודד ותאים נורמלים ישירות על מצעים רכים הידרוג'ל עם microbeads פלורסנט המשובץ למתיחת cytometry. מצעי ג'ל שקופים גם לאפשר immunostaining. assay זה מתגלה הבדלים בארגון F- אקטין והידבקויות מוקד בתאי מעי גס אנושיים עיקריים שינויי מצע נוקשות. פלטפורמת תרבית תאים זה מפותחת את האפשרות לחקור מאפייני biophysical שונים של תאים אנושיים העיקריים כגון תא נוקשות ומתיחה כפרמטרים לprognostics הסרטן.
Protocol
Representative Results
Discussion
לחץ מתיחה סלולרי התפתח לאחרונה כמחוון biophysical פוטנציאל של מדינה גרורתי 13. עם זאת, אין נתונים מתיחה ניסיוניים עם תאי גידול ראשוניים קיימים בספרות עד כה. כמו כן, תאי מעי גס ראשוני מבודדים ישירות culturing על ג'ל polyacrylamide הקשיחות שונה לא דיווחו עדיין. לפיכך, אנו קובעים ת?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was funded by the National Science Foundation ECCS grant 10-02165, and the Interdisciplinary Innovation Initiative Program, University of Illinois grant 12035. M.Y. A. was funded at UIUC from NIH National Cancer Institute Alliance for Nanotechnology in Cancer ‘Midwest Cancer Nanotechnology Training Center’ Grant R25 CA154015A. Immnunostaining and confocal microscopy imaging were carried out at the Institute for Genomic Biology (IGB), UIUC. M.Y.A. acknowledges the discussions with B. J. Williams of UIUC regarding the isolation experiments. M.Y.A. acknowledges C. Nemeh and Abdul Bhuiya of UIUC for assistance in schematic and materials list preparation.
Materials
| Reagents | |||
| HBSS | Life technologies | 14175-095 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Trypsin | Worthington | LS003736 | |
| Collagenese | Worthington | LS004176 | |
| 3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS) | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| Glutaraldehyde | Polysciences, Inc. | 01201-5 | |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| N- methylenebisacrylamide (bis) | Sigma-Aldrich | M1533 | |
| HEPES buffer solution | Sigma-Aldrich | 83264 | |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | |
| Nˊ-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 161-0801 | |
| Human fibronectin | BD biosciences | 354008 | |
| Hydrazine hydrate | Sigma-Aldrich | 18412 | Hazardous |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT15710 | |
| Signal enhancer | Life technologies | I36933 | |
| Monoclonal anti vinculin antibody | Sigma-Aldrich | V9131 | |
| Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life technologies | A11001 | |
| TRITC phalloidin conjugates | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| 0.1 µm fluroscent beads | Life technologies | F8801 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life technologies | 25200-056 | |
| Materials | |||
| 12 mm2 glass cover slips | Corning | 2865-12 |
Riferimenti
- Ingber, D. E. Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment. Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).
- Kumar, S., Weaver, V. M. Mechanics, malignancy, metastasis: the force journey of a tumor cell. Cancer Metastasis Rev. 28, 113-127 (2009).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell Motil. Cytoskeleton. 60, 24-34 (2005).
- Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (25), 3661-3665 (1997).
- Solon, J., Levental, I., Sengupta, K., Georges, P. C., Janmey, P. A. Fibroblast adaptation and stiffness matching to soft elastic substrates. Biophys. J. 93, 4453-4461 (2007).
- Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Substrate flexibility regulates growth and apoptosis of normal but not transformed cells. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 279, 1345-1350 (2000).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
- Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophys. J. 99, 2460-2469 (2010).
- Ali, M. Y., Saif, M. T. A. Substrate Stiffness Mediated Metastasis Like Phenotype of Colon Cancer Cells is Independent of Cell to Gel Adhesion. Cell. Mol. Bioeng. , (2014).
- Ali, M. Y., Chuang, C. Y., Saif, M. T. A. Reprogramming cellular phenotype by soft collagen gels. Soft Matter. , (2014).
- Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7 (2), e32572 (2012).
- Indra, I., Undyala, V., Kandow, C., Thirumurthi, U., Dembo, M., Beningo, K. A. An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity. Phys. Biol. 8 (1), (2011).
- Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival. J. Proteome Res. 5 (4), 862-878 (2006).
- Oikonomou, E., Kothonidis, K., Zografos, G., Nasioulas, G., Andera, L., Pintzas, A. Newly established tumourigenic primary human colon cancer cell lines are sensitive to TRAIL-induced apoptosis in vitro and in vivo. Br. J. Cancer. 97 (1), 73-84 (2007).
- Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. J. Vis. Exp. (91), (2014).
- Wang, Y. L., Pelham, R. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).
- Tang, X., Ali, M. Y., Saif, M. T. A. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8, 3197-3206 (2012).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current Protocols in Cell Biology. , 10-16 (2010).
- Tseng, Q., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell–cell junction positioning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (5), 1506-1511 (2012).
- Chopra, A., et al. Augmentation of integrin-mediated mechanotransduction by hyaluronic acid. Biomaterials. 35 (1), 71-82 (2014).
- Damljanovic, V., Lagerholm, B. C., Jacobson, K. Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamide substrates for cell mechanotransduction assays. Biotechniques. 39 (6), 847-851 (2005).
- Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PLoS ONE. 5 (9), e12905 (2010).
- Ulrich, T. A., de Juan Pardo, E. M., Kumar, S. The mechanical rigidity of the extracellular matrix regulates the structure, motility, and proliferation of glioma cells. Cancer Res. 69, 4167-4174 (2009).
- Williams, B. J., Anand, S. V., Rajagopalan, J., Saif, M. T. A. A self-propelled biohybrid swimmer at low Reynolds number. Nat. Commun. 5, (2014).
