सर्जिकल ऊतकों से प्राथमिक मानव पेट के ट्यूमर कोशिकाओं के अलगाव और ट्रैक्शन Cytometry के लिए शीतल लचीला substrates पर उन्हें सीधे संवर्धन
Summary
A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.
Abstract
कैंसर की कोशिकाओं को एक आसंजन रिसेप्टर्स से बना समन्वित, श्रेणीबद्ध Mechano-रासायनिक प्रणाली और संबद्ध संकेत पारगमन झिल्ली प्रोटीन, cytoskeletal वास्तुकला, और आणविक मोटर्स 1, 2 का उपयोग कर एक जटिल तरीके से यांत्रिक कठोरता मैट्रिक्स का जवाब। Mechanosensitivity विभिन्न कैंसर कोशिकाओं के लिए इन विट्रो में हैं नहीं प्राथमिक मानव कैंसर कोशिकाओं के साथ अमर सेल लाइनों या murine व्युत्पन्न प्राथमिक कोशिकाओं, के साथ मुख्य रूप से जांच की। इसलिए, थोड़ा इन विट्रो में प्राथमिक मानव पेट के कैंसर की कोशिकाओं की mechanosensitivity के बारे में जाना जाता है। इधर, एक अनुकूलित प्रोटोकॉल स्वस्थ और कैंसर शल्य चिकित्सा मानव ऊतकों के नमूनों से प्राथमिक मानव पेट के कोशिकाओं के अलगाव का वर्णन करता है कि विकसित की है। पृथक बृहदान्त्र कोशिकाओं तो फ़ाइब्रोनेक्टिन (एक बाह्य मैट्रिक्स से क्रियाशील substrates के polyacrylamide हाइड्रोजेल और कठोर polystyrene (~ 3.6 GPa कठोरता) (10 किलो पास्कल कठोरता) (2 किलो पास्कल कठोरता) नरम और कठोर पर सफलतापूर्वक संवर्धित कर रहे हैंइस मामले में)। फ्लोरोसेंट microbeads सेल संस्कृति की सतह के पास सॉफ्ट जैल में एम्बेडेड रहे हैं, और कर्षण परख मुक्त ओपन एक्सेस सॉफ्टवेयर का उपयोग कर सेलुलर सिकुड़ा तनाव का आकलन करने के लिए किया जाता है। इसके अलावा, विभिन्न कठोरता substrates पर immunofluorescence माइक्रोस्कोपी सब्सट्रेट कठोरता के एक समारोह के रूप में फोकल adhesions युक्त प्राथमिक सेल आकृति विज्ञान, cytoskeleton संगठन और vinculin के बारे में उपयोगी जानकारी प्रदान करता है।
Introduction
यांत्रिक सूक्ष्म पर्यावरण, जैव-रासायनिक कारकों के अलावा, सेल functionalities के विनियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है कि हाल के वर्षों में यह तेजी से स्पष्ट हो गया है। प्रकोष्ठों भावना और वे 3-7 (2 डी संस्कृति के रूप में) का पालन किया या (3 डी संस्कृति के रूप में) से घिरे हैं, जिस पर सब्सट्रेट कठोरता का जवाब कर सकते हैं। ऐसा करके, कोशिकाओं को उनके भेदभाव 3, आकृति विज्ञान 4, माइग्रेशन / गतिशीलता 5, जैव-भौतिक गुणों 6, विकास 7, और अन्य प्रक्रियाओं न्यूनाधिक कर सकते हैं।
कैंसर कोशिकाओं को भी एक आसंजन रिसेप्टर्स की समन्वित, श्रेणीबद्ध Mechano-रासायनिक संयोजन और संबद्ध संकेत पारगमन झिल्ली प्रोटीन, cytoskeletal वास्तुकला, और आणविक मोटर्स 1, 2 का उपयोग कर 2 डी और 3 डी मैट्रिक्स कठोरता का जवाब। उदाहरण के लिए, स्तन उपकला कोशिकाओं (MECS) 150 पा substrates पर सुसंस्कृत जब कठोरता के समान है कि सामान्य कोष्ठकी पैरेन्काइमा फार्मस्वस्थ स्तन के ऊतकों की। दिलचस्प बात यह है कि वे एक ट्यूमर स्ट्रोमा 8 की कठोरता है कि नकल में stiffer substrates के (> 5,000 पा) पर जब सुसंस्कृत संरचनात्मक और ट्रांसक्रिप्शनल दोनों एक विकासशील ट्यूमर की पहचान, दिखा रहे हैं। इसके अलावा, एक और प्रयोग स्तन tumorigenesis के कोलेजन crosslinking और ईसीएम 9 stiffening के साथ है कि पता चलता है। हाल के प्रयोगों वे physiologically प्रासंगिक कठोरता (20-47 किलो पास्कल) होने 2D substrates पर संवर्धित कर रहे हैं, लेकिन (3.6 GPA) substrates पर बहुत कठोर नहीं जब मानव बृहदान्त्र कार्सिनोमा (HCT-8) कोशिकाओं फेनोटाइप (MLP) जैसे मेटास्टेसिस प्रदर्शित बताते हैं कि 10- 12 ये कोशिकाओं पहले फार्म ट्यूमर की तरह सेल समूहों और फिर परिधि से शुरू, एक दूसरे से अलग कर देना। परिवर्तन वे सेल सेल और सेल ईसीएम आसंजन को कम करने, और प्रवासी हो जाते हैं, पैदा करना होता है, (आर संक्रमण के लिए ई) गोल रूपात्मक करने के लिए इस उपकला के रूप में। इन प्रदर्शन नहीं करते हैं बहुत मुश्किल polystyrene के substrates पर HCT-8 कोशिकाओं सुसंस्कृतघातक लक्षण। इस प्रकार यह HCT-8 कोशिकाओं के कारण उचित सूक्ष्म वातावरण के लिए अपने जोखिम को मेटास्टेटिक बन धारणा रही है कि। यह इन प्रयोगों नहीं प्राथमिक मानव कैंसर कोशिकाओं के साथ अमर कैंसर कोशिका लाइनों या murine व्युत्पन्न प्राथमिक कोशिकाओं, के साथ बाहर किया जाता है कि ध्यान देने योग्य है।
एक ताजा अध्ययन में संवर्धित सेलुलर कर्षण तनाव मेटास्टैटिक कोशिकाओं 13 .इस अध्ययन polyacrylamide जैल पर अलग मानव कैंसर कोशिका लाइनों के लिए कर्षण बल को मापने शामिल है के लिए एक संभावित जैवभौतिक हस्ताक्षर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रस्ताव है। यह मेटास्टेटिक कैंसर की कोशिकाओं को सभी मामलों में 13 में गैर metastatic कोशिकाओं की तुलना में काफी अधिक कर्षण तनाव लागू कर सकते हैं कि पाया जाता है। हालांकि, इन परिणामों सीधे murine व्युत्पन्न स्तन कैंसर कोशिका लाइनों 14 पर पहले प्रकाशित निष्कर्षों के विरोध। इसके अलावा, हाल ही में एक अध्ययन उनके cytoskeletal remodeling के समर्थक में अमर और प्राथमिक मानव कोशिकाओं के बीच उल्लेखनीय मतभेदों पर प्रकाश डाला गयाTein रूपरेखा और सेल अस्तित्व प्रोटीन अभिव्यक्ति 15। इसलिए, यह प्राथमिक मानव कैंसर कोशिकाओं के लिए कर्षण सहित जैवभौतिक assays के कई फिर से आना जरूरी है। प्राथमिक कोशिकाओं अमर कैंसर कोशिका लाइनों कर्षण प्रवृत्ति पुनरावृत्ति है कि क्या इस सवाल को संबोधित करेंगे।
यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल, और नरम substrates (polyacrylamide हाइड्रोजेल) के साथ ही पर पेट्री डिश पर उनके संवर्धन के लिए (स्वस्थ और कैंसर दोनों) प्राथमिक मानव पेट के कोशिकाओं के अलगाव के लिए अनुकूलित है। प्रोटोकॉल पाचन और एकल कक्ष निलंबन 16 में शल्य ऊतक के नमूने के फलस्वरूप enzymatic पृथक्करण पर आधारित है। हमारे ज्ञान करने के लिए, यह सीधे cytometry के कर्षण के लिए एम्बेडेड फ्लोरोसेंट microbeads के साथ नरम हाइड्रोजेल substrates पर पृथक प्राथमिक पेट के ट्यूमर और सामान्य कोशिकाओं संवर्धन का पहला प्रदर्शन है। पारदर्शी जेल substrates के भी immunostaining के लिए अनुमति देते हैं। यह परख पता चला एफ actin संगठन में मतभेद औरसब्सट्रेट कठोरता परिवर्तन के रूप में प्राथमिक मानव बृहदान्त्र कोशिकाओं में फोकल adhesions। यह सेल संस्कृति मंच इस तरह के कैंसर prognostics के लिए मानकों के रूप में सेल कठोरता और कर्षण के रूप में प्राथमिक मानव कोशिकाओं के विभिन्न biophysical गुणों की खोज की संभावना को खोलता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
सेलुलर कर्षण तनाव हाल ही में मेटास्टैटिक राज्य के 13 में से एक संभावित जैवभौतिक संकेतक के रूप में उभरा है। हालांकि, प्राथमिक ट्यूमर कोशिकाओं के साथ कोई प्रयोगात्मक कर्षण डेटा तारीख को साहित्य में ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was funded by the National Science Foundation ECCS grant 10-02165, and the Interdisciplinary Innovation Initiative Program, University of Illinois grant 12035. M.Y. A. was funded at UIUC from NIH National Cancer Institute Alliance for Nanotechnology in Cancer ‘Midwest Cancer Nanotechnology Training Center’ Grant R25 CA154015A. Immnunostaining and confocal microscopy imaging were carried out at the Institute for Genomic Biology (IGB), UIUC. M.Y.A. acknowledges the discussions with B. J. Williams of UIUC regarding the isolation experiments. M.Y.A. acknowledges C. Nemeh and Abdul Bhuiya of UIUC for assistance in schematic and materials list preparation.
Materials
| Reagents | |||
| HBSS | Life technologies | 14175-095 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Trypsin | Worthington | LS003736 | |
| Collagenese | Worthington | LS004176 | |
| 3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS) | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| Glutaraldehyde | Polysciences, Inc. | 01201-5 | |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| N- methylenebisacrylamide (bis) | Sigma-Aldrich | M1533 | |
| HEPES buffer solution | Sigma-Aldrich | 83264 | |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | |
| Nˊ-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 161-0801 | |
| Human fibronectin | BD biosciences | 354008 | |
| Hydrazine hydrate | Sigma-Aldrich | 18412 | Hazardous |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT15710 | |
| Signal enhancer | Life technologies | I36933 | |
| Monoclonal anti vinculin antibody | Sigma-Aldrich | V9131 | |
| Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life technologies | A11001 | |
| TRITC phalloidin conjugates | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| 0.1 µm fluroscent beads | Life technologies | F8801 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life technologies | 25200-056 | |
| Materials | |||
| 12 mm2 glass cover slips | Corning | 2865-12 |
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