אדם Dupuytren של<em> Ex Vivo</em> תרבות לחקר myofibroblasts והתאי מטריקס האינטראקציות

Summary

מחלת Dupuytren (DD) היא מחלה fibroproliferative של כף היד. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לדגימות כריתת התרבות מDD במערכת תלת-ממדי (3D) תרבות. מערכת תרבות לטווח קצר כזה מאפשרת שימור של מבנה 3D ותכונות מולקולריות של רקמת fibrotic.

Abstract

Organ fibrosis or “scarring” is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.

To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells.

As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first “organ” culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

Introduction

מחלת Dupuytren (DD), מחלה fibroproliferative שפירה גורמת כיפוף קבוע של האצבעות עקב היווצרות של גושים וחוטים בכף היד. למרות התפשטות המחלה היא גבוהה במיוחד בקרב לבנים של צפון אירופה, אטיולוגיה הגנטית הבסיסית של המחלה אינה ידועה ^1. המאפיין העיקרי של DD הוא הייצור העודף של מטריצה ​​תאית חלבונים (ECM) (למשל, קולגן), המהווים רקמה סיבית קשה כובשת את המרחב בין הגידים והעור של כף היד והאצבעות, באופן קבוע משבש את התנועות העדינות של היד ^{2, 3.} ההישנות של המחלה מצביעה על שינויים גנטיים בסיסי כגורם לסיסטיק ^{1, 4.} טיפול יעיל יכול להיות למקד ישירות מנגנוני fibrotic בלתי נשלט ברמה התאית ומולקולרית.

העבודה האחרונה שלנו על סיסטיק הובילה אותנו לפיתוחמערכת חדשנית 3D תרבות המאפשרת תרבות לטווח הקצר של רקמת fibrotic אדם עם הפוטנציאל של בדיקות סמים. מערכת זו סייעה להתגבר על הגישה המגבילה של תרבויות פיברובלסטים 2D ולהגדיר תפקיד עבור מטה הרגולציה החלקית, שהושג על ידי דילוג על אקסון, של הפעלת מסלול TGFβ בתיווך סיסטיק ^5.

אנחנו פיתחנו שיטה לתרבות לשעבר vivo דגימות כריתה אנושית מחולי DD ללמוד את האינטראקציה בין myofibroblasts וECM ^{5 שמסביב, 6.} המחקר של סיסטיק רקמת חיבור DD כמו גם המחלות fibrotic אחרות מסתמכת על ניתוח histopathological של נכרת כירורגית דגימות, בידוד של fibroblasts מהרקמה והקמת תרבויות עיקריות או נהלי מיון תא. גישות אלה הן די סטטית שכן הם אינם מאפשרים מניפולציה אקסוגני של נכסי מחלה או התערבות טיפולית על ידי הנסיין. בנוסף, ce העיקריתרבויות ll נוטות להסתגל לתנאי התרבות ומאפייני ביטוי הגנים שלהם שונים במהותה מהמצב בvivo על כל מעבר, גם בקטעים מוקדמים (בין קטע 3 ו -6) ^{7, 8.} יש לנו הצלחנו לשמור על החומר כירורגית הפסולת ב תנאי vivo לשעבר תרבות לתקופת זמן המאפשרת לימוד של מאפייני המטופל ספציפי והקרנה של תרכובות תרופה אנטי-fibrotic או אנטי-דלקתיות.

המערכת מבוססת על קרום nitrocellulose המאפשר מגע של הרקמות עם המדיום אבל לא עם הפלסטיק, ובכך, מונע את השינוי של הרקמה על קובץ מצורף, כפי שנצפה בעבר כאשר culturing fibroblasts DD כמו גם סוגי תאים אחרים ^9. לא ג'ל קולגן או מצע חלבון ECM אחר נדרש, שכן רקמת DD עצמו מייצרת כמויות גדולות של החלבונים האלה. זהו יתרון לשמירה על מייקרו-סביבת ECM ילידים וחטא מחזורמצעי מטריצת ce הם רגולטור חשוב של אדריכלות ותפקוד ^{10, 11} רקמות. לדוגמא, חלבוני ECM כגון פיברונקטין, laminin וקולגן, עשויים להשפיע על קוטביות קדמית אחורית של fibroblasts כדומה מוצג לקוטביות הפסגה-בסיס בתאי האפיתל ^{12, 13} . יש לי תאים מקוטב הפצת א-סימטרית של מולקולות תאיים הקובעת נדידת תאים וביטוי גנים, למשל, נגישות integrin α1β1 על הקרום משפיעה הידבקות תא להקליד אני קולגן ^14. מאז מטרתו העיקרית של מודל זה 3D הייתה לשמר את המיקרו-הסביבה המקומית, שימש לא מצע מטריצת ECM מלאכותי.

בקצרה: דגימות כריתה נחתכות באותה מידה בסביבת סטרילית והניחו על קרומי nitrocellular. אם נדרש טיפול מנוהל באמצעות הזרקת הרקמות מוזרקות לאחר שהונחו על הקרום. אם טיפול אינו דורש להיות מנוהל באמצעות injection אז המתחם מתווסף לתקשורת והתרבות (בינוני של הנשר (DMEM) השתנה Dulbecco, עם 1% בסרום עגל עוברי (FCS), 1% פניצילין, סטרפטומיצין (P / S)). התרבויות נשמרות לתקופה מקסימלית של עשרה ימים לאחר שהרקמה קבועה בparaformaldehyde 4% (PFA), מעובד באמצעות פתרון סוכרוז 30%, משובץ במתחם OCT ומאוחסן ב -80 ° C, כפי שתוארו בעבר ^5.

Protocol

פרוטוקול זה כדלקמן הנחיות LUMC וAMC של ועדת אתיקה מחקר אנושית. 1. הליך כירורגי ואוסף רקמות הערה: למרות שטכניקות שונות לכריתה כירורגית של ההתכווצות של Dupuytren קיימות, תקן הזהב הנוכחי הוא fasciectomy החלקי <s…

Representative Results

השיטה של vivo לשעבר, תרבות 3D של רקמת חיבור היא מערכת להגדיר קלה וחזקה כדי להבין את הקשר בין ECM ומרכיבי תא אחרים המהווים את רקמת DD וסוגים אחרים של פוטנציאל סיסטיק גם כן. יתר על כן מערכת זו מאפשרת שיטה אמינה כדי לבחון את ההשפעה של תרכובות בסוגי תאים שונים והשפעתם על עומ…

Discussion

השלבים הקריטיים ביותר של culturing רקמות חיבור אנושיים vivo לשעבר הם השימוש המיידי של הרקמות לאחר ניתוח להסרת על מנת להבטיח יכולת קיום; הרקמה צריכה להישאר בפתרון בינוני או מלוח בכל העת; לשמור על תרבות סטרילי; חלקים רוחביים של רקמה צריכים להיות עובי 200 מיקרומטר מרבי; להג…

Materials

Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Invitrogen	11965-084
fetal calf serum (FCS)	Gibco		high glucose, heat inactivated
penicillin-streptomycin	Invitrogen	15070-063
Cell culture inserts	Millicell	PIHA01250	0.45um pore size, 12mm diameter
anti-collagen type I	Southern Biotech	1310-08
anti- α smooth muscle actin	Sigma	A2547
anti-collagen type III	Southern Biotech	1330-01
Alexa Fluor555 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A-31570
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody	Invitrogen	A-11055
TOPRO-3	Invitrogen	T3605
methylsalicylate	Sigma	M6752
paraformaldehyde	Sigma	P6148
Tissue Tek OCT	Sakura	25608-930
Microsccope glass coverslips	Menzel-Glaser	BB024060A1	24x60mm
Microscope SuperFrost slides	Menzel-Glaser	AA00000102E	76x26mm
VECTASHIELD HardSet Mounting Medium	Vector laboratories	H-1400
Leica TCS SP5 II confocal microscope	Leica Microsystems		Argon-488, 514 nm and HeNe-633 nm laser lines
Zeiss 710 NLO upright confocal microscope	Jena, Germany		equipped with femtosecond Spectra – Physics Deep See MP laser (Santa Clara, United States) using a Plan -Apochromat 20x/1.0 NA water-immersion objective.