Malattia di Dupuytren (DD) è una malattia fibroproliferativa del palmo della mano. Qui vi presentiamo un protocollo per i campioni della cultura di resezione di DD in un tridimensionale (3D) sistema di coltura. Tale sistema di coltura a breve termine permette conservazione della struttura 3D e proprietà molecolari del tessuto fibrotico.
Organ fibrosis or “scarring” is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.
To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells.
As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first “organ” culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.
Malattia di Dupuytren (DD), una malattia benigna fibroproliferativa provoca la flessione permanente delle dita a causa della formazione di noduli e corde nel palmo della mano. Anche se la diffusione della malattia è particolarmente alta tra i caucasici del Nord Europa, l'eziologia genetica alla base della malattia resta sconosciuta 1. La caratteristica principale del DD è l'eccesso di produzione di matrice extracellulare (ECM) proteine (per esempio, collagene), che costituiscono un tessuto fibroso duro che occupa lo spazio tra i tendini e la pelle del palmo della mano e delle dita, interrompendo definitivamente i movimenti fini della mano 2, 3. La ricorrenza della malattia suggerisce alterazioni genetiche sottostanti come causa di fibrosi 1, 4. Un trattamento efficace potrebbe essere quella di indirizzare direttamente le incontrollabili meccanismi fibrotiche a livello cellulare e molecolare.
Il nostro recente lavoro sulla fibrosi ci ha portato allo sviluppo di unnuovo sistema cultura in 3D che permette di cultura a breve termine di tessuto fibrotico umano con il potenziale di test anti-droga. Questo sistema ha contribuito a superare l'approccio limitazione di colture di fibroblasti 2D e definire un ruolo per la regolazione giù parziali, raggiunti da exon skipping, di TGFβ attivazione della via nella mediazione fibrosi 5.
Abbiamo sviluppato un metodo di coltura ex vivo campioni di resezione umano da pazienti DD di studiare l'interazione tra miofibroblasti e ECM circostante 5, 6. Lo studio della fibrosi tessuto connettivo DD nonché altre malattie fibrotiche basa sull'analisi istopatologica del escisso chirurgica esemplari, l'isolamento dei fibroblasti del tessuto e la creazione di colture primarie o procedure di separazione delle cellule. Questi approcci sono alquanto statico in quanto non consentono la manipolazione delle proprietà esogena malattia o intervento terapeutico dallo sperimentatore. Inoltre, ce primariall culture tendono ad adattarsi alle condizioni di coltura e le loro proprietà di espressione genica differiscono sostanzialmente dalla situazione in vivo su ogni passaggio, anche durante i primi passaggi (tra il passaggio 3 e 6) 7, 8. Siamo riusciti a mantenere il materiale chirurgico rifiuti ex vivo condizioni di coltura per un periodo di tempo che permette lo studio delle caratteristiche specifiche del paziente e lo screening di composti farmacologici anti-fibrotiche o anti-infiammatori.
Il sistema si basa su una membrana di nitrocellulosa che permette il contatto del tessuto con il mezzo, ma non con la plastica, quindi, impedendo l'alterazione del tessuto su di attaccamento, come precedentemente osservato quando la coltura fibroblasti DD così come altri tipi di cellule 9. Non è richiesta alcuna gel di collagene o altro substrato proteine ECM, poiché la stessa tessuto DD produce grandi quantità di queste proteine. Questo è vantaggioso per il mantenimento dei nativi microambiente ECM e il fatturato del peccatosubstrati matrice ce sono importante regolatore dell'architettura del tessuto e della funzione 10, 11. Ad esempio, le proteine ECM, come fibronectina, laminina e collagene, possono influenzare la polarità anteriore-posteriore fibroblasti come simile mostrati per polarità apicale-basale in cellule epiteliali 12, 13 . cellule polarizzate hanno una distribuzione asimmetrica di molecole extracellulari che determina la migrazione delle cellule e l'espressione genica, ad esempio, l'accessibilità α1β1 integrina sulla membrana colpisce adesione delle cellule al collagene di tipo I 14. Dal momento che l'obiettivo primario di questo modello 3D è stato quello di preservare il microambiente nativo, è stato utilizzato alcun substrato matrice ECM artificiale.
In breve: campioni di resezione sono ugualmente tagliati in un ambiente sterile e posti su membrane nitrocellular. Se è richiesto un trattamento somministrato tramite iniezione i tessuti vengono iniettati dopo che sono state collocate sulla membrana. Se il trattamento non ha bisogno di essere amministrato via injezione poi il composto viene aggiunto al mezzo di coltura (Dulbecco Modified mezzo di Eagle (DMEM), con siero fetale di vitello 1% (FCS), 1% di penicillina-streptomicina (P / S)). Le colture vengono mantenute per un massimo di dieci giorni dopo che il tessuto è fissato in 4% paraformaldeide (PFA), elaborati attraverso soluzione di saccarosio al 30%, incorporato in OCT e conservati a -80 ° C, come descritto in precedenza 5.
Le fasi più critiche di coltura ex vivo tessuto connettivo umano sono l'uso immediato del tessuto dopo la rimozione chirurgica per garantire la redditività; il tessuto dovrebbe rimanere in soluzione salina media o in ogni momento; mantenere una cultura sterile; sezioni trasversali di tessuto devono avere spessore massimo di 200 micron; set up del sistema di coltura ex vivo è ottimale quando il tessuto è in contatto con il mezzo ma non completamente sommerso. Piano dovrebbe essere aggiunto solo …
The authors have nothing to disclose.
The authors are thankful to the nurses at the AMC that have facilitated the tissue collection. We would also like to acknowledge A.M.A. van der Laan for excellent technical support with the SHG and the two-photon imaging.
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 11965-084 | |
fetal calf serum (FCS) | Gibco | high glucose, heat inactivated | |
penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
Cell culture inserts | Millicell | PIHA01250 | 0.45um pore size, 12mm diameter |
anti-collagen type I | Southern Biotech | 1310-08 | |
anti- α smooth muscle actin | Sigma | A2547 | |
anti-collagen type III | Southern Biotech | 1330-01 | |
Alexa Fluor555 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A-31570 | |
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody | Invitrogen | A-11055 | |
TOPRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
methylsalicylate | Sigma | M6752 | |
paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
Tissue Tek OCT | Sakura | 25608-930 | |
Microsccope glass coverslips | Menzel-Glaser | BB024060A1 | 24x60mm |
Microscope SuperFrost slides | Menzel-Glaser | AA00000102E | 76x26mm |
VECTASHIELD HardSet Mounting Medium | Vector laboratories | H-1400 | |
Leica TCS SP5 II confocal microscope | Leica Microsystems | Argon-488, 514 nm and HeNe-633 nm laser lines | |
Zeiss 710 NLO upright confocal microscope | Jena, Germany | equipped with femtosecond Spectra – Physics Deep See MP laser (Santa Clara, United States) using a Plan -Apochromat 20x/1.0 NA water-immersion objective. |