Menneskelig Dupuytrens<em> Ex Vivo</em> Kultur for studier av myofibroblasts og ekstracellulære matriks Interactions
Summary
Dupuytrens sykdom (DD) er en fibroproliferative sykdom i håndflaten. Her presenterer vi en protokoll til kultur reseksjonsnivå prøver fra DD i en tredimensjonal (3D) kultur system. Slike korttidskultur systemet tillater preservering av 3D-strukturen og molekylære egenskaper av fibrotisk vev.
Abstract
Organ fibrosis or “scarring” is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.
To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells.
As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first “organ” culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.
Introduction
Dupuytrens sykdom (DD), en godartet fibroproliferative sykdommen forårsaker permanent strekking av fingrene på grunn av dannelse av knuter og snorer i håndflaten. Selv om sykdommen spredningen er særlig høy blant kaukasiere i Nord-Europa, den underliggende genetisk etiologi av sykdommen er fortsatt ukjent en. De viktigste kjennetegn ved DD er overflødig produksjon av ekstracellulære matrix (ECM) proteiner (f.eks kollagen), som danner en tøff bindevev opptar plassen mellom sener og hud av håndflaten og fingrene, permanent forstyrre den fine bevegelser av hånden 2, 3. Den tilbakefall av sykdommen antyder liggende genetiske endringer som en årsak til fibrose 1, 4. En effektiv behandling kan være å målrette direkte de ukontrollerbare fibrotiske mekanismer på cellulært og molekylært nivå.
Våre siste arbeidet med fibrose har ført oss til utviklingen av enny 3D-kultur-system som gjør det mulig kortvarig kultur av human fibrotisk vev med potensialet av legemiddeltesting. Dette systemet har bidratt til å overvinne den begrensende tilnærming av 2D fibroblastkulturer og å definere en rolle for den delvise nedregulering, oppnås ved ekson hoppetau for aktivering TGFp banen i å mediere fibrose 5.
Vi har utviklet en metode for å kultur ex vivo human reseksjon prøver fra DD-pasienter for å studere interaksjonen mellom myofibroblasts og den omgivende ECM 5, 6. Studiet av DD bindevev fibrose, så vel som andre fibrotiske sykdommer som er avhengig av histopatologisk analyse av det utskårede kirurgisk prøver, isolering av fibroblaster fra vevet og etablering av primære cellekulturer eller sorteringsprosedyrer. Disse metodene er ganske statisk, siden de ikke tillater eksogene manipulasjon av sykdoms egenskaper eller terapeutisk intervensjon ved eksperimentator. I tillegg primær cell kulturer har en tendens til å tilpasse seg forholdene kultur og deres genuttrykk egenskaper avvike vesentlig fra in vivo situasjon ved hver passering, selv under tidlige passasjer (blant passasje 3 og 6) 7, 8. Vi har klart å opprettholde avfall kirurgisk materiale i ex vivo dyrkningsbetingelser for en tidsperiode som tillater undersøkelse av pasientspesifikke egenskaper og screening av anti-fibrotiske eller anti-inflammatoriske medikament-forbindelser.
Systemet er basert på en nitrocellulosemembran som tillater kontakt av vevet med mediet, men ikke med plast, og dermed hindre endring av vev ved festing, som tidligere observert ved dyrkning DD fibroblaster, så vel som andre celletyper 9. Ingen kollagen-gel eller andre ECM-protein-substrat er nødvendig, siden DD vevet i seg selv produserer store mengder av disse proteiner. Dette er fordelaktig for opprettholdelse av nativt ECM mikromiljøet og omsetning syndce matrikssubstrater er viktig regulator av vev arkitektur og funksjon 10, 11. For eksempel ECM-proteiner som fibronektin, laminin og kollagen, kan påvirke front-bak polaritet av fibroblaster som på samme måte som vises for apikal-basal polaritet i epitelceller 12, 13 . Polarisert celler har asymmetrisk fordeling av ekstracellulære molekyler som bestemmer cellemigrasjon og genuttrykk, f.eks α1β1 inte tilgjengelighet på membranen påvirker celleadhesjonen å skrive kollagen 14. Siden en primære målet med denne 3D-modellen var å bevare den opprinnelige mikromiljøet, ble ingen kunstige ECM matrise underlaget brukes.
I korte trekk: reseksjon prøvene er likt delt i et sterilt miljø og plassert på nitrocellular membraner. Ved behandling administreres via injeksjon er nødvendig vevene blir injisert etter at de har blitt plassert på membranen. Hvis behandlingen ikke krever å bli administrert via injection deretter forbindelsen blir tilsatt til kulturmediet (Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM), med 1% føtalt kalveserum (FCS), 1% penicillin-streptomycin (P / S)). Kulturene ble opprettholdt i maksimalt ti dager, hvoretter vevet er fiksert i 4% paraformaldehyd (PFA), behandlet gjennom 30% sukrose-oppløsning, innebygd i oktober forbindelse og lagret ved -80 ° C, som tidligere beskrevet 5.
Protocol
Representative Results
Discussion
De mest kritiske trinn å dyrke ex vivo human bindevev er den umiddelbare anvendelse av vev etter kirurgisk fjerning for å sikre levedyktighet; vevet bør forbli i medium eller saltoppløsning til enhver tid; opprettholde et sterilt kultur; tverrgående deler av vev skal ha maksimalt 200 mikrometer tykkelse; satt opp av ex vivo kultursystem er optimal når vev er i kontakt med mediet, men ikke helt neddykket. Mediet bør legges bare på utsiden av kammeret transwell i et lite volum (for eksempel</…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors are thankful to the nurses at the AMC that have facilitated the tissue collection. We would also like to acknowledge A.M.A. van der Laan for excellent technical support with the SHG and the two-photon imaging.
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 11965-084 | |
| fetal calf serum (FCS) | Gibco | high glucose, heat inactivated | |
| penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Cell culture inserts | Millicell | PIHA01250 | 0.45um pore size, 12mm diameter |
| anti-collagen type I | Southern Biotech | 1310-08 | |
| anti- α smooth muscle actin | Sigma | A2547 | |
| anti-collagen type III | Southern Biotech | 1330-01 | |
| Alexa Fluor555 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A-31570 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody | Invitrogen | A-11055 | |
| TOPRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
| methylsalicylate | Sigma | M6752 | |
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Tissue Tek OCT | Sakura | 25608-930 | |
| Microsccope glass coverslips | Menzel-Glaser | BB024060A1 | 24x60mm |
| Microscope SuperFrost slides | Menzel-Glaser | AA00000102E | 76x26mm |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium | Vector laboratories | H-1400 | |
| Leica TCS SP5 II confocal microscope | Leica Microsystems | Argon-488, 514 nm and HeNe-633 nm laser lines | |
| Zeiss 710 NLO upright confocal microscope | Jena, Germany | equipped with femtosecond Spectra – Physics Deep See MP laser (Santa Clara, United States) using a Plan -Apochromat 20x/1.0 NA water-immersion objective. |
Riferimenti
- Shih, B., Bayat, A. Scientific understanding and clinical management of Dupuytren disease. Nat Rev Rheumatol. 6 (12), 715-726 (2010).
- Bisson, M. A., McGrouther, D. A., Mudera, V., Grobbelaar, A. O. The different characteristics of Dupuytren’s disease fibroblasts derived from either nodule or cord: expression of α-smooth muscle actin and the response to stimulation by TGF-β1. The Journal of Hand Surgery. 28 (4), 351-356 (2003).
- Brickley-Parsons, D., Glimcher, M. J., Smith, R. J., Albin, R., Adams, J. P. Biochemical changes in the collagen of the palmar fascia in patients with Dupuytren’s disease. The Journal of Bone & Joint Surgery. 63 (5), 787-797 (1981).
- Berndt, A., Kosmehl, H., Katenkamp, D., Tauchmann, V. Appearance of the myofibroblastic phenotype in Dupuytren’s disease is associated with a fibronectin, laminin, collagen type IV and tenascin extracellular matrix. Pathobiology. 62 (2), 55-58 (1994).
- Karkampouna, S., et al. Novel ex vivo culture method for the study of Dupuytren’s disease: effects of TGFβ type 1 receptor modulation by antisense oligonucleotides. Mol Ther Nucleic Acids. 3, e142 (2014).
- Kruithof-de Julio, M., et al. Canonical Wnt signaling regulates Nkx3.1 expression and luminal epithelial differentiation during prostate organogenesis. Developmental Dynamics. 242 (10), 1160-1171 (2013).
- Krause, C., Kloen, P., ten Dijke, P. Elevated transforming growth factor β and mitogen-activated protein kinase pathways mediate fibrotic traits of Dupuytren’s disease fibroblasts. Fibrogenesis & Tissue Repair. 4 (1), 14 (2011).
- Gorman, D. B., Wu, Y., Seney, S., Zhu, R. D., Gan, B. S. Wnt expression is not correlated with beta-catenin dysregulation in Dupuytren’s Disease. J Negat Results Biomed. 5, 13 (2006).
- Streuli, C. H., Schmidhauser, C., Kobrin, M., Bissell, M. J., Derynck, R. Extracellular matrix regulates expression of the TGF-beta 1 gene. The Journal of Cell Biology. 120 (1), 253-260 (1993).
- Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (4), 265-275 (2006).
- Gottrup, F., Ågren, M. S., Karlsmark, T. Models for use in wound healing research: A survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue. Wound Repair and Regeneration. 8 (2), 83-96 (2000).
- Gudjonsson, T., et al. Normal and tumor-derived myoepithelial cells differ in their ability to interact with luminal breast epithelial cells for polarity and basement membrane deposition. Journal of Cell Science. 115 (1), 39-50 (2002).
- Xu, R., Boudreau, A., Bissell, M. Tissue architecture and function: dynamic reciprocity via extra- and intra-cellular matrices. Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1-2), 167-176 (2009).
- Jokinen, J., et al. Integrin-mediated cell adhesion to type I collagen fibrils. Journal of Biological Chemistry. 279 (30), 31956-31963 (2004).
- Au-Yong, I. T. H., Wildin, C. J., Dias, J. J., Page, R. E. A review of common practice in Dupuytren surgery. Techniques in Hand & Upper Extremity Surgery. 9 (4), 178-187 (2005).
- Deries, M., Collins, J. J. P., Duxson, M. J. The mammalian myotome: a muscle with no innervation. Evolution & Development. 10 (6), 746-755 (2008).
- Deries, M., et al. Extracellular matrix remodeling accompanies axial muscle development and morphogenesis in the mouse. Developmental Dynamics. 241 (2), 350-364 (2012).
- Martins, G. G., et al. Dynamic 3D Cell Rearrangements Guided by a Fibronectin Matrix Underlie Somitogenesis. PLoS ONE. 4 (10), e7429 (2009).
- Yokomizo, T., et al. Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos. Nat. Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).
- Karkampouna, S., de Julio, M. K. r. u. i. t. h. o. f. -. Fibrosis: a novel approach for an old problem. Receptors & Clinical Investigation. 1 (5), (2014).
- Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Seminars in Cell & Developmental Biology. 20 (8), 931-941 (2009).
- Freund, I., Deutsch, M., Sprecher, A. Connective tissue polarity. Optical second-harmonic microscopy, crossed-beam summation, and small-angle scattering in rat-tail tendon. Biophysical Journal. 50 (4), 693-712 (1986).
- Mohler, W., Millard, A. C., Campagnola, P. J. Second harmonic generation imaging of endogenous structural proteins. Methods. 29 (1), 97-109 (2003).
- Boulesteix, T., et al. Micrometer scale ex vivo multiphoton imaging of unstained arterial wall structure. Cytometry Part A. 69A (1), 20-26 (2006).
- Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (5), 349-363 (2002).
- Hinz, B., Mastrangelo, D., Iselin, C. E., Chaponnier, C., Gabbiani, G. Mechanical tension controls granulation tissue contractile activity and myofibroblast differentiation. The American Journal of Pathology. 159 (3), 1009-1020 (2001).
- Eastwood, M., McGrouther, D. A., Brown, R. A. A culture force monitor for measurement of contraction forces generated in human dermal fibroblast cultures: evidence for cell-matrix mechanical signalling. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – General Subjects. 1201 (2), 186-192 (1994).
- Verjee, L. S., Midwood, K., Davidson, D., Eastwood, M., Nanchahal, J. Post-transcriptional regulation of α-smooth muscle actin determines the contractile phenotype of Dupuytren’s nodular cells. Journal of Cellular Physiology. 224 (3), 681-690 (2010).
