Dupuytren Humano do<em> Ex Vivo</em> Cultura para o Estudo da Miofibroblastos e Matriz Extracelular Interações

Summary

Doença de Dupuytren (DD) é uma doença fibroproliferativa da palma da mão. Aqui, apresentamos um protocolo para espécimes cultura de ressecção de DD em um (3D) sistema de cultura tridimensional. Tal sistema de cultura de curto prazo permite a preservação da estrutura 3D e propriedades moleculares do tecido fibrótico.

Abstract

Organ fibrosis or “scarring” is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.

To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells.

As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first “organ” culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

Introduction

Doença de Dupuytren (DD), uma doença benigna fibroproliferativa provoca a flexão permanente dos dedos, devido à formação de nódulos e os cabos de na palma da mão. Embora a propagação da doença é particularmente elevado entre os caucasianos do norte da Europa, a etiologia genética subjacente da doença permanece desconhecida ^1. A principal característica do DD o excesso de produção de proteínas da matriz extracelular (ECM) (por exemplo, colagénio), que formam um tecido fibroso resistente que ocupa o espaço entre os tendões e pele da palma da mão e dos dedos, interromper permanentemente os movimentos finos da mão ^{2, 3.} A recorrência da doença sugere alterações genéticas subjacentes como causa da fibrose ^{1, 4.} Um tratamento eficaz pode ser de alvejar diretamente os mecanismos fibróticas incontroláveis ​​a nível celular e molecular.

Nosso trabalho recente sobre a fibrose nos levou ao desenvolvimento de umnovo sistema de cultura 3D que permite a cultura de curto prazo de tecido fibrótico humano com o potencial de teste de drogas. Este sistema tem ajudado a superar a abordagem limitante de culturas de fibroblastos em 2D e para definir um papel para a regulação para baixo parcial, conseguida por exon skipping, de TGF ativação da via na mediação fibrose ^5.

Desenvolvemos um método para a cultura ex vivo a partir de amostras de ressecção humano doentes DD para estudar a interacção entre miofibroblastos e a ECM circundante ^{5, 6.} O estudo de DD fibrose do tecido conjuntivo bem como outras doenças fibróticas baseia-se na análise histopatológica do cirúrgico excisado espécimes, o isolamento de fibroblastos a partir do tecido e estabelecimento de culturas primárias ou de procedimentos de separação de células. Estas abordagens são completamente estática, uma vez que não permitem a manipulação exógena das propriedades de doença ou intervenção terapêutica por parte do experimentador. Além disso, ce primárioll culturas tendem a adaptar-se às condições de cultura e suas propriedades de expressão de genes diferem essencialmente da situação in vivo em cima de cada passagem, mesmo durante os primeiros trechos (entre passagem 3 e 6) ^{7, 8.} Conseguimos manter o material cirúrgico resíduos em ex vivo condições de cultivo para um período de tempo que permite o estudo das características específicas do paciente e de triagem de compostos de drogas anti-fibróticas ou anti-inflamatórios.

O sistema baseia-se numa membrana de nitrocelulose, que permite o contacto do tecido com o suporte, mas não com o plástico, assim, evitar a alteração do tecido após a fixação, como observado anteriormente, quando a cultura de fibroblastos DD, bem como outros tipos de células ^9. Não é necessário um gel de colagénio ou outro substrato de proteína da MEC, desde o próprio tecido DD produz grandes quantidades dessas proteínas. Isto é vantajoso para a manutenção do microambiente ECM nativa e pecado rotatividadesubstratos de matriz ce são importante regulador da arquitetura e da função ^{10, 11} tecido. Por exemplo, proteínas da MEC como a fibronectina, laminina e colágeno, podem influenciar polaridade traseira e dianteira de fibroblastos como semelhante mostrados para polaridade apical-basal em células epiteliais ^{12, 13} . células polarizadas têm uma distribuição assimétrica de moléculas extracelulares, que determina a migração celular e a expressão do gene, por exemplo, acessibilidade integrina α1β1 na membrana afecta a adesão das células ao colagénio do tipo I ^14. Desde um objetivo primário deste modelo 3D era preservar o microambiente nativa, não foi utilizado nenhum substrato matriz ECM artificial.

Em resumo: as amostras de ressecção são igualmente cortar em um ambiente estéril e colocadas em membranas nitrocellular. Se for necessário um tratamento administrado por via de injecção os tecidos são injectadas após terem sido colocados sobre a membrana. Se o tratamento não necessita de ser administrado via injec ç ã o, em seguida, o composto é adicionado ao meio de cultura (Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), com 1% de soro fetal de vitelo (FCS), 1% de penicilina-estreptomicina (P / S)). As culturas são mantidas durante um período máximo de 10 dias, após o que o tecido é fixado em paraformaldeído a 4% (PFA), processados ​​através de uma solução de sacarose a 30%, embebidos em composto PTU e armazenado a -80 ° C, como descrito anteriormente ^5.

Protocol

Este protocolo segue as diretrizes LUMC e AMC do comitê de ética em pesquisa humana. 1. Procedimento Cirúrgico e Cobrança Tissue Nota: Apesar de existirem várias técnicas para a excisão cirúrgica da contratura de Dupuytren, o padrão ouro atual é a facectomia parcial 15. A maioria dos doentes são tratados no dia-a cirurgia clínica. Realizar a cirurgia sob anestesia geral ou regional, de acordo com as preferências do paciente e an…

Representative Results

O método de ex vivo, a cultura 3D de tecido conjuntivo é um conjunto up sistema fácil e robusta para entender a relação entre ECM e outros componentes de células que constituem o tecido DD e potencialmente outros tipos de fibrose também. Além disso, este sistema permite que um método fiável para testar os efeitos dos compostos sobre diferentes tipos de células e os seus efeitos sobre a carga 20 fibrótica. As etapas de coleta de resíduos de material cirúrgico…

Discussion

Os passos mais críticos de cultura ex vivo de tecido conjuntivo humano são o uso imediato do tecido após a remoção cirúrgica para assegurar a viabilidade; o tecido deve permanecer na solução de meio ou soro fisiológico em todos os momentos; manter uma cultura estéril; cortes transversais de tecido deve ter espessura máxima de 200 m; configurar o sistema de cultura ex vivo é óptima quando o tecido está em contacto com o suporte, mas não totalmente submerso. Meio deve ser adicionado apenas…

Materials

Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Invitrogen	11965-084
fetal calf serum (FCS)	Gibco		high glucose, heat inactivated
penicillin-streptomycin	Invitrogen	15070-063
Cell culture inserts	Millicell	PIHA01250	0.45um pore size, 12mm diameter
anti-collagen type I	Southern Biotech	1310-08
anti- α smooth muscle actin	Sigma	A2547
anti-collagen type III	Southern Biotech	1330-01
Alexa Fluor555 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A-31570
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody	Invitrogen	A-11055
TOPRO-3	Invitrogen	T3605
methylsalicylate	Sigma	M6752
paraformaldehyde	Sigma	P6148
Tissue Tek OCT	Sakura	25608-930
Microsccope glass coverslips	Menzel-Glaser	BB024060A1	24x60mm
Microscope SuperFrost slides	Menzel-Glaser	AA00000102E	76x26mm
VECTASHIELD HardSet Mounting Medium	Vector laboratories	H-1400
Leica TCS SP5 II confocal microscope	Leica Microsystems		Argon-488, 514 nm and HeNe-633 nm laser lines
Zeiss 710 NLO upright confocal microscope	Jena, Germany		equipped with femtosecond Spectra – Physics Deep See MP laser (Santa Clara, United States) using a Plan -Apochromat 20x/1.0 NA water-immersion objective.