Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue
Summary
The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.
Abstract
The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.
Introduction
以下に記載されたプロトコルの目的は、細胞型特異的遺伝子発現、タンパク質発現、あるいはエピジェネティックマーカーのその後の分析のために、神経組織の不均質な集団から個々の細胞型を単離することです。脳は、異なる前駆細胞に由来する多くの細胞型で構成され、それは、細胞型特異的な特性及び機能を有します。これらの違いにもかかわらず、これらの異なる神経細胞型は、測定または従来の方法を使用して、細胞型特異的に解釈することは困難で、これらの複数のユビキタスタンパク質の分析を行う類似の受容体および細胞内シグナル伝達分子を発現することができます。神経科学者は、脳内のこれらの異なる細胞型の機能および活性化を識別する必要があり、これは最終的には神経学的および神経精神疾患のためのより具体的な薬剤および治療標的を同定するための最初のステップになるように、彼らは個別に動作に影響を与えることができる方法。 Tにもかかわらず、神経科学研究の彼の包括的な目的は、遺伝子またはタンパク質発現、シグナル伝達分子の活性化、またはDNAにエピジェネティックマーカーの修飾を分析するための脳からの個々の神経細胞型を単離することは困難であっできます。細胞型特異的マーカーの追加の染色と組み合わせた場合、これは適切にタンパク質を染色することができる特異的な抗体に依存しているが、現在使用されている技術のうち、免疫組織化学は、細胞型特異的な様式でタンパク質の発現を同定することができます興味のある、それはin situハイブリダイゼーションでは 、脳内の個々の細胞内メッセンジャーリボ核酸（mRNA）の特定の局在を同定することができる。定量化することは困難であるが、これは、特定の細胞型の同時分析を制限する骨の折れるプロセスであり、のみ関心のある1または多分少数の遺伝子の分析を可能にします。レーザーキャプチャーマイクロダイセクションは、視覚化される細胞の亜集団を単離するためにレーザーを使用して顕微鏡を介して、しかし、このプロセスの時間がかかり、自然と比較的低い収率が著しく、これらの分子の発現はそもそも低い場合は特に、タンパク質またはmRNAレベルのその後の分析を制限することができます。蛍光活性化細胞選別（FACS）は、神経科学の分野では比較的新しい技術は、遺伝子発現1および/ またはエピジェネティックなターゲット2のその後の分析のために脳からの個々の細胞型を単離することです。このプロセスは、細胞型特異的遺伝子発現、タンパク質発現、またはエピジェネティックマーカーのその後の分析のために神経細胞の特定のタイプを分類するために使用することができます。 FACSは、物理的または生化学的特徴3のいずれかに基づいて異なる細胞をカウントし、ソートするために、このような数十年のための癌および免疫学などの医学研究のフィールドの数で使用されています。また、フローサイトメトリー古典特異的な抗体を用いて、セルごとにタンパク質の発現を分析するために使用されているフロー。以下の手順は、分子生物学のエンドポイントの、その後の分析のために個々の細胞型を単離するために、古典的なフローサイトメトリー技術を利用します。フローサイトメーターは、上述した技術への迅速かつ効率的な代替手段になります第二に、数千の細胞を分析することができます。さらに、細胞は、特定のタンパク質（例えば、神経伝達物質受容体）、または2つ以上のタンパク質（特定の細胞型における複数のタンパク質の共局在化）の組み合わせの細胞の発現に基づいて単離することができます。これにより、ユーザは、脳内でそれらの機能を識別するために、それらの分子の特性に基づいて、非常に選択的な神経細胞タイプを単離することができます。
FACSを実施するために、神経細胞は、それらが光ビームと分析のためのレーザを通して単一ファイルを通過するように細胞を搬送し、整列フローセルを通過する単一の細胞懸濁液中に調製されます。コンピュータは、各セルとpからデータを取得します。指定されたパラメータ（サイズ、粒度、および蛍光）の分析のためのヒストグラム上たくさんそれを。これらのパラメータに基づいて、細胞はすぐに記憶し、所望の任意のエンドポイントの、その後の分析のために別々のチューブに選別することができます。以下に記載されているプロトコルは、（分化分子11B、のCD11b抗体のクラスタを使用して）（胸腺細胞抗原1、はThy1抗体を使用して）、ニューロン、アストロサイト（グリアグルタミン酸トランスポーター、GLT1抗体を使用して）、およびミクログリアをソートする3つの抗体を利用しています。以下に説明する、または1つが自分の実験のために隔離したい細胞のタイプに応じて異なる抗体で修飾されたように、このプロトコルを使用することができます。
このプロトコルは、特定の実験のために適切であるかどうかを判断する際に考慮すべきいくつかの注意事項があります。一つの大きな注意点は1つが隔離したい特定の細胞型に関係することができます。このプロトコルでは、使用される3つの抗体は、その細胞外の抗体であります実験者は、このように内部のRNA、DNAおよびタンパク質の完全性を維持し、染色手順の間、無傷の細胞型を維持することを可能にします。それは一つだけで、特定の細胞内で発現されるタンパク質を同定する抗体を使用して、特定の神経細胞型を単離することを望む可能性があります。例えば、1はヒドロキシラーゼをチロシンまたはコリンアセチルトランスフェラーゼに対する抗体を用いたアセチルコリン神経細胞を単離するために抗体を用いてドーパミン作動性ニューロンを分離することができます。これらのタンパク質は、細胞内であり、従って、適切な抗体を用いたその後の染色のために細胞膜の固定および透過処理を必要とします。これは、4,5の前に行われてきたが、このプロセスはかなりこれらの透過性細胞からのRNAまたはDNAの収量を減少させることができます。もう一つの注意点は、すべての抗体は、FACSに適していることであってもよいです。例えば、1は現在、ウェスタンブロットのために非常にうまく機能する抗体、Dを必要と技術を使用してもよいですタンパク質のenaturation。この抗体は、必ずしもタンパク質がこのプロトコルのいずれかの時点で変性されていないので、抗体は、その固有の抗原に結合する方法がないことが指定されたFACSを使用してこれらの細胞型の同定に適していないかもしれません。企業は、抗体が承認されたアプリケーションを特定仕様書を提供しています。抗体は、フローサイトメトリーのために承認されていない場合には、特定の抗体を用いて、このプロトコルを試みてから1を妨げるべきではありません。しかし、人はそれをFACSのために動作することが保証されていないことに注意する必要があります。このプロトコルの第三の注意点は1つが隔離しようとしている細胞の数に関係しています。 FACSは、組織の小さな作品から可能なほとんどの細胞を得るための優れた手法であるが、それは1つが比較的小さな脳の領域から細胞の比較的まばらな集団を単離する場合は、一匹の動物からの収量がすることも可能であり、本質的に低いこと。この場合には、とすることができますその後の分析のために必要な細胞数を得るために同一の治療群の数匹の動物からの脳組織をプールすることが必要。しかしながら、最近の刊行物は、遺伝子発現を分析することが可能であることを示す、より大きなセットソートニューロンから起動ニューロン（5〜6％）の少数の遺伝子発現のその後の分析のためのcDNAの遺伝子標的プレ増幅を使用してい動物6この技術の最後の警告を大量にプールすることなく、神経細胞の小さなサブセットから一つが離れすぎていないセルソーターへのアクセス権を持つべきであるということです。セルソーターは、それを適切に使用するにはかなりの訓練を必要とする複雑な機械です。したがって、これらのマシンは、多くの場合、中核施設で資格のある技術者によって運営されています。また、この手順の目標は、おそらく（、神経組織を解離特異的抗体のためにそれを染色し、直ちに短時間でソータにこれらのサンプルを取ることです半日）。この時間枠は、単離された細胞の生存率および収率を増加させ、後続の処理および分析のための細胞の完全性を維持するのに役立ちます。上述のこれらのパラメータの全てが満たされている場合、FACSは、神経組織からの遺伝子およびタンパク質の細胞型特異的発現を分析するための優れた方法です。
全ての実験は、実験動物の管理と使用に関するデラウェア大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）と健康ガイドの国立研究所に従って行いました。
Protocol
Representative Results
Discussion
Similar to many other tissues and systems, the brain is comprised of a heterogeneous cell population that functions together to impact behavior. The analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications from individual cells within that heterogeneous population has the potential to reveal information about the function of the system as a whole, to identify cellular processes regulating both normal behavior and disease processes, and to provide cell-type-specific targets for potential therapies. It …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Lynn Opdenaker at the University of Delaware Center for Translational Research at the Helen F. Graham Cancer Center for technical assistance, as well as Nancy Martin from the Duke University Cancer Institute Flow Cytometry Shared Resource, and Dr. Susan H. Smith for guidance in methods and data collection.
Materials
| Neural Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| Myelin Removal Beads II | Miltenyi Biotec | 130-096-733 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Nylon Mesh Sheet | Amazon | CMN-0074-10YD | 40 inch width, 80 micron size mesh |
| Fc Block / anti-CD32 | BD Biosciences | BDB550270 | reactivity for rat |
| APC-conjugated CD11b antibody | Biolegend | 201809 | reactivity for rat |
| Rabbit anti-GLT1 | Novus Biologicals | NBP1-20136 | reactivity for rat or human |
| PE-conjugated anti-rabbit secondary antibody | eBioscience | 1037259 | secondary antibody for anti-GLT1 |
| FITC-conjugated anti-rat CD90 (Thy1) mouse antibody | Biolegend | 202504 | reactivity for rat |
Riferimenti
- Schwarz, J. M., Smith, S. H., Bilbo, S. D. FACS analysis of neuronal-glial interactions in the nucleus accumbens following morphine administration. Psychopharmacology. 230 (4), 525-535 (2013).
- Schwarz, J. M., Hutchinson, M. R., Bilbo, S. D. Early-life experience decreases drug-induced reinstatement of morphine CPP in adulthood via microglial-specific epigenetic programming of anti-inflammatory IL-10 expression. J Neurosci. 31 (49), 17835-1523 (2011).
- Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nature Immunology. 7 (7), 681-685 (2006).
- Guez-Barber, D., et al. FACS identifies unique cocaine-induced gene regulation in selectively activated adult striatal neurons. J Neurosci. 31 (11), 4251-4259 (2011).
- Fanous, S., et al. Unique gene alterations are induced in FACS-purified Fos-positive neurons activated during cue-induced relapse to heroin seeking. J Neurochem. 124 (1), 100-108 (2013).
- Liu, Q. R., et al. Detection of molecular alterations in methamphetamine-activated Fos-expressing neurons from single rat dorsal striatum using fluorescence-activated cell sorting (FACS). J Neurochem. 128 (1), 173-185 (2013).
- Guez-Barber, D., et al. FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain. J Neurosci Methods. 203 (1), 10-18 (2012).
- Nolte, C., et al. GFAP promoter-controlled EGFP-expressing transgenic mice: a tool to visualize astrocytes and astrogliosis in living brain tissue. Glia. 33 (1), 72-86 (2000).
- Okana, M., Bell, D. W., Haber, D. A., Li, E. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell. 99 (3), 247-257 (1999).
- Bogdanović, O., Veenstra, G. J. DNA methylation and methyl-CpG binding proteins: developmental requirements and function. Chromosoma. 118 (5), 549-565 (2009).
- Iwamoto, K., et al. Neurons show distinctive DNA methylation profile and higher inter-individual variations compared with non-neurons. Genome Res. 21 (5), 688-696 (2011).
- Nishioka, M., et al. Neuronal cell-type specific DNA methylation patterns of the Cacna1c gene. Int J Dev Neurosci. 31 (2), 89-95 (2013).
- Kozlenkov, A., et al. Differences in DNA methylation between human neuronal and glial cells are concentrated in enhancers and non-CpG sites. Nucleic Acid Res. 42 (1), 109-127 (2014).
- Russo, S. J., et al. Nuclear factor kappa B signaling regulates neuronal morphology and cocaine reward. J Neurosci. 29 (11), 3529-3537 (2009).
- Bhatt, D., Ghosh, S. Regulation of the NF-κB-Mediated Transcription of Inflammatory Genes. Front Immunol. 5, 71 (2014).
- Okada, S., et al. Flow cytometric sorting of neuronal and glial nuclei from central nervous system tissue. J Cell Physiol. 226 (2), 552-558 (2011).
