Bir Floresan Gümrükleme Testi kullanarak Zebra balığı Böbrek Fonksiyon Değerlendirilmesi
Summary
Zebra balığı, kronik böbrek hastalığı (KBH) modellemek için popüler bir araçtır. Ancak, kendi küçük boyutu imkansız geleneksel yöntemlerle böbrek fonksiyonlarını değerlendirmek için yapar. Biz CKD zebrafish böbrek fonksiyonunun kantitatif analiz sağlayan bir floresan boya böbrek boşluk tahlil 1 açıklar.
Abstract
Zebra balığı embriyo organogenezi çalışma ve insan genetik hastalık modellemek için bir uysal bir model sunuyor. Göreli basitliğine rağmen, Zebra balığı böbrek geliştirir ve insanlar hemen hemen aynı şekilde çalışır. İnsan böbrek yapımında önemli bir fark sadece iki olan Zebra balığı göre nefron milyonlarca varlığıdır. Ancak, temel fonksiyonel birimler halinde böyle karmaşık bir sistemin basitleştirilmesi böbrek geliştirir ve nasıl çalıştığını anlayışımızı destekli etti. Zebra balığı, glomerulus bulunduğu orta hat cloaca birbirine kaynaştırarak önce embriyonik eksen aşağı ikili çalıştırmak sapmak iki Pronephric tübüllerine ilk kan filtrasyon sorumludur. Pronephric tübüller ağır nihayet cloaca 2-4 vasıtasıyla çıkmadan önce çeşitli çözünenlerin alışverişini sağlayan, parçalı tübül boyunca süzülen maddenin hareketini kolaylaştıran hareketli kirpikler tarafından doldurulur. CKD, inc sorumlu Birçok genlerciliogenesis ile ilgili olanlar luding, zebrabalıkları 5 incelenmiştir. Ancak, büyük bir beraberlik geri genetik manipülasyon sonra Zebra balığı böbrek fonksiyonunu değerlendirmede zorluk olmuştur. İnsanlar çoğunlukla nedeniyle sucul ortamda ve küçük boyutu, Zebra balığı olmayan translasyonel kanıtladık Geleneksel tahliller böbrek disfonksiyonu ölçmek için. Örneğin, embriyonik üre ve kreatinin içeriğinin analizi için balık kademeli gelen bunlar çok küçük oldukları gibi, kan çıkarmak için fiziksel olarak mümkün değildir. Buna ek olarak, Zebra balığı genellikle ilk hasta muayeneleri sırasında yapılan basit bir proteinüri 'yağ çubuğu' üzerinde test için yeterli idrar üretemezler. Böbrek fonksiyonu 1,6-9 üzerinden bir okuma vermek için, damar ile ilgili ve dışarı böbrek yoluyla niceliksel olarak, zaman içinde, bir floresan boya açıklık izlemek için zebrabalıkları optik saydamlığı kullanan bir floresan deneyi tarif eder.
Introduction
İnsan böbrek kanından metabolik atıkların filtreleme ve hücresel homeostazı sürdürmek için gerekli eriyiklerin kurtarma önemli bir rol oynar. Böbrek fonksiyon bozukluğuna neden olan insan genetik hastalıkların bir dizi vardır. En yaygın kalıtsal böbrek hastalığı böbrek tübülleri içindeki sıvı dolu keseler gelişimi ile karakterize otozomal dominant polikistik böbrek hastalığı (polikistik böbrek) 'dir; cystogenesis kaynaklanan hasar böbrek fonksiyonu 10 için zararlıdır. 800-1: polikistik böbrek 1 oluştuğunun vardır 1,000 ve 8 hesapları – son dönem böbrek yetmezliği (SDBY), 11 hastada% 10. Birkaç genler yaklaşık% 85 ve sırasıyla 12,13 vakaların% 15 için muhasebe, polikistin-1 (PKD1) ve -2 (PKD2) dahil ADPKD neden suçlanmıştır. Ayrıca, gen PKD1 ürünleri ve -2 cilium lokalize ve ciliogenesis 14,15 temelidir. Olarak bilinen insan genetik bozukluklar, tanınmış bir aile artık varkirpikler fonksiyonunu etkileyebilir ve CKD 16 neden ciliopathies.
siliyer gelişimini ve fonksiyonunu etkileyen insan genetik hastalıkların giderek artan sayıda bu kez kabul körelmiş organel küresel ilgi çekiyor. kirpik, saç benzeri hücresel çıkıntı, reseptörler ve anahtar hücre sinyal olayları transdüksiyonu için gerekli iyon kanalları ile zenginleştirilmiştir. kirpik tipik olarak ya da tekil mikrotübül merkezi bir çift olmaksızın dokuz radyal olarak düzenlenmiş mikrotübül çifti içine yapılandırılmış bir mikrotübül göre aksonem oluşur. axonemal yapısı siliyer eylem türünü ve modunu tanımlar. 9 + 2 mikrotübül düzenlemesi epitel yüzeyleri boyunca sıvıların hareketi kullanılmaktadır kirpiğin hareketliliğini bahşeder. 9 + 0 yapılandırması olmayan hareketlidir ama hücresel sinyal olaylar 17 ağırlıklı olarak işlev inanılmaktadır. Dışında CKD gelen, siliyer disfonksiyon sonuçları karakteristik bir dizi vardır, obezite, retina dejenerasyonu, polidaktili ve kognitif bozukluk 16 dahil ciliopathy özellikleri. Ancak, CKD hastanın yaşam kalitesi en zararlı ve bu nedenle silier ilgili CKD için vivo modellerde uygun gelişiminin arkasındaki önemli bir itici güç arasındadır.
Zebra balığı, insan genetik hastalığının etyolojisi anlamak için mükemmel bir model. Bunların pratik geliştirme, yumurta, çok sayıda şeffaf doku ve eski in utero büyüme üretimi zebra balığı gelişim süreçleri görsel ve biyolojik etkinlik önemli kolaylıkla idare edilmesine olanak sağlamaktadır. Genler genetik, genom düzenleme araçları (CRISPR 18 ve TALENS 19) son başarısını kullanılarak değiştirilmiş antisens morfolino teknolojisi kullanılarak 20 nakavt, ya da farmakolojik onların su ortamında bileşiklerin eklenmesi ile kontrol edilebilir. Nitekim, Zebra balığı e üstlenmek için bir platform sunuyoruzDiğer hayvan modellerinde izin veren değil xperiments. Zebra balığı iken insanlarda ile birçok ortak işlevsel korunmuş organları, genleri ve sinyalizasyon işlemleri paylaşan (insanlara kıyasla) nispeten basit omurgalılar vardır. Örneğin, Zebra balığı böbrek insanlara 21,22 oranla yapısında ve fonksiyonunda oldukça benzer. Ancak, fazların bir arkaya yoluyla gelişir memeli böbrek aksine, her bir daha gelişmiş böbrek (pronephros, mezonefros ve metanephros) ile işaretlenmiş, embriyonik zebrafish sadece bir pronephros, bir böbreğin en olgunlaşmamış formu geliştirir. Nefron milyonlarca memeli böbrek yapı taşlarını oluşturan bulunabilir iken, Zebra balığı embriyo sadece iki sahip. İlk kan süzülen kısım için izin glomerüller, aort orta hatta sadece ventral olarak kaynaşmıştır. Cloaca yoluyla çıkmak için önce eritme, eksen boyunca kaudal çalıştırmak Pronephric tübüllerine glomerüllerden kan filtreleri. Pronephric tubules ağır kaudal çıkış 3,4 doğru süzülen maddenin akışına toleranslılar hareketli kirpikler ile kirpikli edilir. Bu basit Pronephric yapı onlar sonunda bir daha karmaşık yapıya mezonefros 21 haline larva büyümenin birkaç hafta boyunca Zebra balığı homeostazı korur. Bununla birlikte, zebra balığı, bir metanephros 21 geliştirir olmadı. Zebra balığı özel duruma rağmen, zebra balığı nefron memelilerde görülen eşit gen sentezleme profilleri ile bölümlere ve böylece nefrogenezisi 3,22 in vivo modelinde rakipsiz sunmaktadır.
Rutin hasta, kan ve idrar testleri bir dizi böbrek fonksiyonu için test edilir. Tipik haliyle, kan çözülmüş tuzları, üre, kreatinin için analiz edilir. Üre, kreatinin ve anormal tuz konsantrasyonu yüksek düzeyde böbrek fonksiyonu ile ilgili sorunlar göstergesidir. Bir kolorimetrik çubuğunu kullanarak İdrar tahlili proteini, bloo anormal seviyelerini algılard irin, bakteri ve idrar örneklerinde şeker mevcut. Kanın 10 ml – Bu gibi testler, normal olarak idrar yaklaşık 30 ml ya da 5 gerektirir. Bu esas olarak tahlili gerçekleştirmek için yeterli kan ya da idrar toplama imkansız olması sebebiyle, söz zebrabalıkları gibi in vivo model organizmaların, küçük deneylerde, bu tür çevirmek için zor olmuştur. Burada, biz uygun zebrabalıkları böbrek fonksiyon testleri eksikliğini gidermek ve çalışma için yenilikçi bir teknik tarif. Kan akışı içine bir floresan boya enjekte edilmesi Böbreğin ile kandan süzme ve floresan aktivitesi atılımını izlemek ve ayrı ayrı zaman içinde ölçmek mümkündür. Bu yöntem, bir örnek teşkil hastalığın neden olduğu böbrek hasarı, çalışma için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebra balığı, insan genetik hastalık modellemek için değerli bir araç sunmak, in vivo araştırma için bilimsel bir enstrüman olarak kullanılması böbrek dahil olmak üzere birçok biyolojik sistemlerin, genetik arıza detaylı çalışmalar sağlamıştır. Çok şimdi Zebra balığı böbrek geliştirir ve işlevleri nasıl anlaşılmaktadır. İnsan nefrogenezisi ve hastalığa neden olan genlerin 21 ile homoloji çarpıcı benzerlikler anlamada temel hale nasıl Zebra balığı resimli…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Jaipreet Bharj tarafından sağlanan teknik destek. Bu çalışma, AB-FP7 (SYSCILIA -241.955) ve Hollanda Böbrek Vakfı (CP11.18) hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| P-97 SUTTER Flaming/Brown type micropipette puller | Intracel | P-97 | |
| borosilicate standard wall capillaries | Harvard Apparatus | 30-0017 | |
| Glass microscope slides | VWR International | 631-0109 | |
| Epoxy Resin Glue | Evo-Stik | ||
| Rhodamine B 10,000 MW labeled Dextran | Life technologies | D-1824 | |
| N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| air compressor | Jun-Air | OF302-15 | |
| Picospritzer III | Parker Instruments | 051-0500-900 | |
| compact 3-axis control micromanipulator | Marzhauser | MM33 | |
| Dissecting stereo microscope | Nikon | SMZ1000 | |
| microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Dumont #5 forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| stage micrometer | Pyser- SGI | 02A00404 |
Riferimenti
- Hentschel, D. M., et al. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), 923-929 (2005).
- Drummond, I. Making a zebrafish kidney: a tale of two tubes. Trends Cell Biol. 13 (7), 357-365 (2003).
- Ma, M., Jiang, Y. J. Jagged2a-notch signaling mediates cell fate choice in the zebrafish pronephric duct. PLoS Genet. 3 (1), e18 (2007).
- Liu, Y., Pathak, N., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. Notch signaling controls the differentiation of transporting epithelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros. Development. 134 (6), 1111-1122 (2007).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16 (2), 299-304 (2005).
- Cardenas-Rodriguez, M., et al. Characterization of CCDC28B reveals its role in ciliogenesis and provides insight to understand its modifier effect on Bardet-Biedl syndrome. Hum Genet. 132 (1), 91-105 (2013).
- Osborn, D. P., et al. Loss of FTO antagonises Wnt signaling and leads to developmental defects associated with ciliopathies. PLoS One. 9 (2), e87662 (2014).
- Pearson, C. G., Osborn, D. P., Giddings, T. H., Beales, P. L., Winey, M. Basal body stability and ciliogenesis requires the conserved component Poc1. J Cell Biol. 187 (6), 905-920 (2009).
- Tobin, J. L., Beales, P. L. Restoration of renal function in zebrafish models of ciliopathies. Pediatr Nephrol. 23 (11), 2095-2099 (2008).
- Torres, V. E., Harris, P. C. Autosomal dominant polycystic kidney disease: the last 3 years. Kidney Int. 76 (2), 149-168 (2009).
- Bogdanova, N., Markoff, A., Horst, J. Autosomal dominant polycystic kidney disease – clinical and genetic aspects. Kidney Blood Press Res. 25 (5), 265-283 (2002).
- Harris, P. C., Ward, C. J., Peral, B., Hughes, J. Polycystic kidney disease. 1: Identification and analysis of the primary defect. J Am Soc Nephrol. 6 (4), 1125-1133 (1995).
- Reynolds, D. M., et al. Aberrant splicing in the PKD2 gene as a cause of polycystic kidney disease. J Am Soc Nephrol. 10 (11), 2342-2351 (1999).
- Pazour, G. J., San Agustin, a. j. t., Follit, J. A., Rosenbaum, J. L., Witman, G. B. Polycystin-2 localizes to kidney cilia and the ciliary level is elevated in orpk mice with polycystic kidney disease. Curr Biol. 12 (11), R378-R380 (2002).
- Yoder, B. K., Hou, X., Guay-Woodford, L. M. The polycystic kidney disease proteins, polycystin-1, polycystin-2, polaris, and cystin, are co-localized in renal cilia. J Am Soc Nephrol. 13 (10), 2508-2516 (2002).
- Baker, K., Beales, P. L. Making sense of cilia in disease: the human ciliopathies. Am J Med Genet C Semin Med Genet. 151C (4), 281-295 (2009).
- Veland, I. R., Awan, A., Pedersen, L. B., Yoder, B. K., Christensen, S. T. Primary cilia and signaling pathways in mammalian development, health and disease. Nephron Physiol. 111 (3), 39-53 (2009).
- Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Eisen, J. S., Smith, J. C. Controlling morpholino experiments: don’t stop making antisense. Development. 135 (10), 1735-1743 (2008).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 559-585 (2013).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3 (10), 1922-1938 (2007).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio Rerio). , (2000).
- Forsythe, E., Beales, P. L. Bardet-Biedl syndrome). Eur J Hum Genet. 21 (1), 8-13 (2013).
- Corbetta, S., et al. High prevalence of simple kidney cysts in patients with primary hyperparathyroidism. J Endocrinol Invest. 32 (8), 690-694 (2009).
- Veleri, S., et al. Knockdown of Bardet-Biedl syndrome gene BBS9/PTHB1 leads to cilia defects. PLoS One. 7 (3), e34389 (2012).
- Vize, P., Woolf, A. S., Bard, J. . The Kidney: From Normal Development to Congenital Disease. , (2003).
- Chang, R. L., et al. Permselectivity of the glomerular capillary wall to macromolecules. II. Experimental studies in rats using neutral dextran. Biophys J. 15 (9), 887-906 (1975).
