Tensione e Calcio mappatura ottica a doppio canale di Colta HL-1 atriale miociti monostrato
Summary
This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.
Abstract
Mappatura ottico ha dimostrato di essere una tecnica utile per rilevare l'attività elettrica cardiaca sia cuori intatta ex vivo e in monostrati miociti in coltura. Cellule HL-1 sono stati ampiamente utilizzati come un modello cellulare 2-dimensionale per studiare diversi aspetti della fisiologia cardiaca. Tuttavia, è stata una grande sfida per la mappa otticamente calcio (Ca) transienti e potenziali d'azione contemporaneamente dallo stesso campo visivo in una colta HL-1 monostrato cellulare atriale. Questo perché è necessario trattamento e la cura speciale per preparare le cellule sane che possono essere catturati elettricamente e otticamente mappate. Pertanto, abbiamo sviluppato un protocollo di lavoro ottimale per la doppia mappatura ottica del canale. In questo manoscritto, abbiamo descritto in dettaglio come eseguire l'esperimento di mappatura ottica doppio canale. Questo protocollo è uno strumento utile per migliorare la comprensione del potenziale d'azione propagazione e cinetica Ca in sviluppo aritmia.
Introduction
Un calcio unico (Ca) e la tensione (V m) doppia mappatura ottica del canale tecnica 1-5 sta emergendo come uno strumento efficace per registrare simultaneamente i segnali V m e Ca sia cuori intatti e monostrati di cellule in coltura. Questa tecnica permette di ottenere informazioni potenti sul rapporto tra transienti di calcio e potenziali di azione per meglio comprendere i meccanismi elettrofisiologici sottostanti di aritmie cardiache.
Monostrati di cellule in coltura hanno dimostrato di essere un modello cellulare utile per studiare elettrofisiologia cardiaca e il meccanismo alla base di aritmie. 4,6-8 HL-1 le cellule sono una linea di cultura myocyte atriale ben caratterizzato. Cellule HL-1 mantengono anche un genotipo e fenotipo differenziato in modo univoco che include morfologica, elettrofisiologico, e le caratteristiche farmacologiche di miociti atriali adulti. Queste cellule esprimono geni e proteine cardiache, tra cui important canali ionici cardiaci (ie, L- e canali del calcio di tipo T) 9 e isoforme maturi di proteine contrattili sarcomeriche normalmente presenti nei miociti atriali adulti come gli altri e ci hanno già segnalato. 10-13 Inoltre, HL-1 le cellule possono essere colta per formare un 2-dimensionale (2-D) miociti monostrato. Così, i vantaggi dell'utilizzo di colture monostrato HL-1 sono: 1) il costo relativamente più basso e più facile da mantenere una linea di cultura miociti di isolare e coltura miociti neonatali primarie; 2) un monostrato confluente di cellule riduce la complessità strutturale che derivano dalla struttura 3-D del cuore; 3) un monostrato di cellule in grado di eliminare l'interferenza della fibrosi interstiziale che si verifica nel cuore intatta. Questo può essere utilizzato per analizzare specifiche funzioni elettrofisiologiche di un gruppo di miociti senza interferenze di fibroblasti e matrice interstiziale; 4) valutazione delle conseguenze funzionali di manipolazione farmacologica o genetica in culmonostrati cellulari turati possono essere efficacemente raggiunti. Pertanto, HL-1 le cellule sono diventate un modello cellulare ampiamente utilizzato per studiare diversi aspetti della fisiologia miociti e attività elettriche anormali stimolazione indotta. 13-16 Tuttavia, la gestione e la cura speciale è richiesto per la cultura monostrati di cellule sane che rispondono a esterni La stimolazione elettrica per gli studi di mappatura ottica. Inoltre, la doppia procedura di tintura colorazione fluorescente potrebbe facilmente danneggiare l'integrità della coltura monostrati di cellule confluenti. Pertanto, l'esecuzione di V m / CA a doppio canale di mappatura ottica in coltura HL-1 monolayers è stata una grande sfida.
L'obiettivo di questo metodo è quello di fornire i passaggi chiave per l'esecuzione con successo doppia mappatura ottica del canale in coltura HL-1 monostrati. Qui abbiamo fornito ampi dettagli su un protocollo ottimizzato per la preparazione monostrato HL-1 cellule, doppia mappatura ottica canale di un monostrato di cellule in coltura, e l'elaborazione dei dati di mappatura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo articolo descrive gli aspetti chiave della mappatura ottica in una colta HL-1 atriale myocyte monostrato colorati con coloranti fluorescenti sensibili di calcio e di tensione. Esso comprende coltura un ottimo HL-1 monostrato cellulare, l'installazione delle apparecchiature di mappatura, mappando un monostrato colta, e l'analisi dei dati.
Per mappare con successo cellule in coltura, la chiave è quello di preparare un monostrato cellulare uniformemente distribuito. Quando la se…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare il Dott Claycomb per la fornitura di cellule HL-1 e protocollo dettagliato di manutenzione. Vorremmo anche ringraziare la signora Elena Carrillo e il Dr. Seth Robia per la loro assistenza con la generazione di film cellulare e Mr. Pete Caron per la sua assistenza con fare alcuni accessori per il nostro sistema duale mappatura ottica del canale.
Questo lavoro è stato sostenuto da American Heart Association (10GRNT3770030 & 12GRNT12050478 a XA), National Institutes of Health (HL113640 a XA), e Loyola University Development Fund Research (a XA).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Rhod2 dry powder | AAT Bioquest | 21062 | |
| pluronic | AAT Bioquest | 20050 | |
| DMSO | sigma | 276855 | |
| Rh237 | Invitrogen | S-1109 | |
| NaCl | sigma | S7653 | |
| KCl | sigma | P3911 | |
| KH2PO4 | sigma | P0662 | |
| NaH2PO4 | sigma | S9638 | |
| MgSO4 | sigma | M7506 | |
| D-Glucose | sigma | G8270 | |
| NaHCO3 | sigma | S6014 | |
| CaCl2 | sigma | C3881 | |
| HEPEs | sigma | H3375 |
Riferimenti
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