Tensão e cálcio Dual Channel Mapping Optical do Cultivadas HL-1 Atrial miócitos Monolayer
Summary
This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.
Abstract
Mapeamento Optical tem provado ser uma técnica valiosa para detectar a atividade elétrica cardíaca em ambos intacta ex vivo corações e em monocamadas miócitos em cultura. Células HL-1 têm sido amplamente utilizados como um modelo celular de 2-dimensional para o estudo de diversos aspectos da fisiologia cardíaca. No entanto, tem sido um grande desafio para o mapa opticamente cálcio (Ca) transientes e potenciais de ação simultaneamente a partir do mesmo campo de visão em um HL-1 monocamada de células cultivadas atrial. Isto porque manuseio e cuidado especial é necessário para preparar as células saudáveis que podem ser eletricamente capturados e opticamente mapeadas. Por conseguinte, foi desenvolvido um protocolo de trabalho óptima para o mapeamento óptico de canal duplo. Neste manuscrito, temos descrito em detalhes como realizar o experimento mapeamento óptico de canal duplo. Este protocolo é uma ferramenta útil para melhorar a compreensão da propagação do potencial de ação e cinética de Ca no desenvolvimento de arritmia.
Introduction
A única cálcio (Ca) e tensão (V m) técnica de mapeamento óptico de canal duplo 1-5 está a emergir como uma ferramenta eficiente para gravar simultaneamente sinais V m e Ca em ambos os corações intactos e monocamadas de células em cultura. Esta técnica torna possível obter informações poderoso sobre a relação entre transientes de cálcio e os potenciais de acção para compreender melhor os mecanismos subjacentes electrofisiológicas de arritmias cardíacas.
As monocamadas de células cultivadas têm provado ser um modelo útil para estudar celular electrofisiologia cardíaca e o mecanismo subjacente de arritmias. 4,6-8 células HL-1 são uma linha de cultura dos miócitos atriais bem caracterizado. Células HL-1 também manter um genótipo e fenótipo diferenciado com exclusividade, que inclui morfológica, eletrofisiológico, e as características farmacológicas dos miócitos atriais adultos. Estas células expressam genes e proteínas cardíacas, incluindo important canais iónicos cardíacos (ou seja, L e canais de cálcio do tipo T) 9 e isoformas de proteínas maduras contrácteis sarcoméricas normalmente encontrado nos miócitos atriais adultos como os outros e que têm relatado anteriormente. 10-13 Além disso, as células HL-1 pode ser cultivadas para formar uma 2-dimensional (2-D) monocamada de miócitos. Assim, as vantagens de usar cultivadas monocamadas de HL-1 incluem: 1) custo relativamente mais baixo e mais fácil de manter uma linha de cultura de miócitos de isolar e cultivar os miócitos neonatais primários; 2) uma monocamada confluente de células reduz as complexidades estruturais que resultam da estrutura 3-D do coração; 3) uma monocamada de células pode eliminar a interferência de fibrose intersticial que ocorre no coração intacto. Isto pode ser utilizado para dissecar funções específicas electrofisiológicas de um grupo de miócitos, sem interferência de fibroblastos e da matriz intersticial; 4) avaliação das consequências funcionais a partir de manipulação farmacológica ou genética na culmonocamadas de células Tured pode ser efetivamente alcançado. Portanto, HL-1 células tornaram-se um modelo celular amplamente utilizado para estudar diversos aspectos da fisiologia dos miócitos, bem como atividades elétricas anormais induzida por estimulação. 13-16 No entanto, manuseio e cuidados especiais são necessários para a cultura monocamadas de células saudáveis que respondem a externo A estimulação eléctrica para estudos de mapeamento óptico. Além disso, o processo de coloração do corante fluorescente dupla pode facilmente danificar a integridade de monocamadas confluentes de células cultivadas. Assim, a realização V m / CA dual channel mapeamento óptico no cultivadas HL-1 monocamadas tem sido um grande desafio.
O objetivo deste método é fornecer os principais passos para a realização com êxito mapeamento óptico de canal duplo em cultivadas HL-1 monocamadas. Aqui nós fornecemos detalhes abrangentes sobre um protocolo otimizado para preparação monocamada HL-1 celular, mapeamento óptico de canal duplo de uma monocamada de células cultivadas, e processamento de dados de mapeamento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artigo descreve os principais aspectos do mapeamento óptico em um culto HL-1 miócitos atrial monocamada coradas com cálcio e tensão corantes fluorescentes sensíveis. Ele inclui a cultura de um HL-1 monocamada de células ideal, configuração dos equipamentos de mapeamento, o mapeamento de uma monocamada de culto, e análise de dados.
Para mapear com sucesso células em cultura, é a chave para preparar uma monocamada de células distribuídas uniformemente. Quando semear as célul…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer ao Dr. Claycomb para fornecer células HL-1 e protocolo de manutenção detalhado. Gostaríamos também de agradecer Ms. Elena Carrillo e Dr. Seth Robia por sua assistência com a geração de o filme celular e Mr. Pete Caron por sua ajuda com fazer alguns acessórios para o nosso sistema de mapeamento óptico de canal duplo.
Este trabalho foi financiado pela American Heart Association (10GRNT3770030 & 12GRNT12050478 para XA), os Institutos Nacionais de Saúde (HL113640 para XA) e Loyola Fundo de Desenvolvimento Research University (a XA).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Rhod2 dry powder | AAT Bioquest | 21062 | |
| pluronic | AAT Bioquest | 20050 | |
| DMSO | sigma | 276855 | |
| Rh237 | Invitrogen | S-1109 | |
| NaCl | sigma | S7653 | |
| KCl | sigma | P3911 | |
| KH2PO4 | sigma | P0662 | |
| NaH2PO4 | sigma | S9638 | |
| MgSO4 | sigma | M7506 | |
| D-Glucose | sigma | G8270 | |
| NaHCO3 | sigma | S6014 | |
| CaCl2 | sigma | C3881 | |
| HEPEs | sigma | H3375 |
Riferimenti
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