Spänning och Kalcium Dual Channel Optisk Kartläggning av odlade HL-1 förmaks myocyt Monolayer
Summary
This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.
Abstract
Optisk kartläggning har visat sig vara en värdefull teknik för att upptäcka hjärt elektrisk aktivitet på både intakta ex vivo hjärtan och i odlade myocyt monolager. HL-1-celler har använts i stor utsträckning som en 2-dimensionell cellulär modell för att studera olika aspekter av hjärt fysiologi. Det har dock varit en stor utmaning att optiskt karta kalcium (Ca) transienter och aktionspotentialer samtidigt från samma synfält i en kultiverad HL-1 förmaks encellsskiktet. Detta beror på att särskild hantering och vård krävs för att förbereda friska celler som kan vara elektriskt fångas och optiskt mappade. Därför har vi utvecklat en optimal arbetsprotokoll för dual channel optisk kartläggning. I detta manuskript, har vi beskrivit i detalj hur man utför dual channel optiska kartläggning experiment. Detta protokoll är ett användbart verktyg för att öka förståelsen av aktionspotentialen förökning och Ca kinetik i arytmi utveckling.
Introduction
En unik kalcium (Ca) och spänning (V m) dual channel optisk kartläggning teknik 1-5 växer fram som ett effektivt verktyg för att samtidigt spela in V m och Ca-signaler i både intakta hjärtan och odlade cellmonoskikt. Denna teknik gör det möjligt att få kraftfulla uppgifter om förhållandet mellan kalcium transienter och aktionspotentialer för att bättre förstå de bakomliggande elektrofysiologiska mekanismer av hjärtarytmier.
Odlade cellmonoskikt har visat sig vara en användbar cellulär modell för att studera hjärtats elektrofysiologi och den underliggande mekanismen för arytmier. 4,6-8 HL-1-celler är en väldefinierad förmaks myocyte kultur linje. HL-1 celler upprätthåller också ett unikt differentierad genotyp och fenotyp som inkluderar morfologiska, elektro och farmakologiska egenskaper hos vuxna förmaks myocyter. Dessa celler uttrycker hjärt gener och proteiner, inklusive important hjärt jonkanaler (dvs, L- och T-typ calciumkanalblockerare) 9 och mogna isoformer av sarcomeric kontraktila proteiner som normalt hos vuxna förmaks myocyterna som andra och vi har tidigare rapporterat. 10-13 Dessutom kan HL-1 celler vara odlas för att bilda en 2-dimensionell (2-D) myocyt monolager. Således fördelarna med att använda odlade HL-1 monolager inkluderar: 1) relativt lägre kostnad och lättare att underhålla en myocyt kulturlinje än att isolera och odla primära neonatala myocyter; 2) ett sammanflytande monoskikt av celler minskar de strukturella komplexiteten som resulterar från den 3-dimensionella strukturen av hjärtat; 3) ett cellmonoskikt kan eliminera påverkan av interstitiell fibros som förekommer i den intakta hjärtat. Detta kan användas för att dissekera specifika elektrofysiologiska funktioner en grupp myocyter utan inblandning av fibroblaster och interstitiell matrix; 4) utvärdering av funktionella konsekvenser från farmakologisk eller genmanipulation i Culturerade ceUmonolager effektivt kan uppnås. Därför har HL-1 celler blivit en allmänt använd cellulär modell för att studera olika aspekter av myocyt fysiologi samt stimulerings-inducerad onormala elektriska aktiviteter. 13-16 är dock speciell hantering och skötsel som krävs för att kulturen friska cellmonoskikt som svarar på extern elektrisk stimulering för optiska kartläggningsstudier. Dessutom kan dubbla fluorescerande färgämne färgningsförfarandet enkelt skada integriteten för odlade konfluenta cellmonoskikt. Således har utför V m / CA tvåkanals optisk kartläggning i odlade HL-1-monolager varit en stor utmaning.
Målet med denna metod är att ge de viktigaste stegen för att framgångsrikt utföra dual channel optisk kartläggning i odlade HL-1-monolager. Här har vi gett omfattande information om ett optimerat protokoll för beredning HL-1 encellsskiktet, dual channel optisk kartläggning av en odlad cell monolager, och kartläggning databehandling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den här artikeln beskriver de viktigaste aspekterna av optisk kartläggning i en kultiverad HL-1 förmaks myocyt monolager färgas med kalcium och spänningskänsliga fluorescerande färger. Det innefattar att odla en optimal HL-1 encellsskiktet, konfigurering av utrustning för kartläggning, mappa en kultiverad monolager, och dataanalys.
För att framgångsrikt kart odlade celler, är nyckeln till att förbereda en jämnt fördelad cellmonolager. När sådd cellerna på att täck, se till…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Dr Claycomb för att ge HL-1 celler och detaljerade underhållsprotokoll. Vi vill också tacka Ms Elena Carrillo och Dr Seth Robia för deras hjälp med att generera cell filmen och Mr Pete Caron för hans hjälp med att göra en del tillbehör för vår dubbla kanaler optiska kartsystem.
Detta arbete stöddes av American Heart Association (10GRNT3770030 & 12GRNT12050478 till XA), National Institutes of Health (HL113640 till XA), och Loyola University Research utvecklingsfonden (till XA).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Rhod2 dry powder | AAT Bioquest | 21062 | |
| pluronic | AAT Bioquest | 20050 | |
| DMSO | sigma | 276855 | |
| Rh237 | Invitrogen | S-1109 | |
| NaCl | sigma | S7653 | |
| KCl | sigma | P3911 | |
| KH2PO4 | sigma | P0662 | |
| NaH2PO4 | sigma | S9638 | |
| MgSO4 | sigma | M7506 | |
| D-Glucose | sigma | G8270 | |
| NaHCO3 | sigma | S6014 | |
| CaCl2 | sigma | C3881 | |
| HEPEs | sigma | H3375 |
Riferimenti
- Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).
- Salama, G., Hwang, S. M., et al. Simultaneous optical mapping of intracellular free calcium and action potentials from Langendorff perfused hearts. Current protocols in cytometry / editorial board, J. Paul Robinson, managing editor … [et al.]. 12 (Unit 12 17), (2009).
- Laurita, K. R., Singal, A. Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 280 (5), H2053-H2060 (2001).
- Fast, V. G. Simultaneous optical imaging of membrane potential and intracellular calcium. J Electrocardiol. 38 (4 Suppl), 107-112 (2005).
- Sowell, B., Fast, V. G. Ionic mechanism of shock-induced arrhythmias: role of intracellular calcium. Heart Rhythm. 9 (1), 96-104 (2012).
- Fast, V. G., Kleber, A. G. Microscopic conduction in cultured strands of neonatal rat heart cells measured with voltage-sensitive dyes. Circ Res. 73 (5), 914-925 (1993).
- Hou, L., et al. A major role for HERG in determining frequency of reentry in neonatal rat ventricular myocyte monolayer. Circ Res. 107 (12), 1503-1511 (2010).
- Beauchamp, P., et al. Relative contributions of connexins 40 and 43 to atrial impulse propagation in synthetic strands of neonatal and fetal murine cardiomyocytes. Circ Res. 99 (11), 1216-1224 (2006).
- Xia, M., et al. Functional expression of L- and T-type Ca2+ channels in murine HL-1 cells. J Mol Cell Cardiol. 36 (1), 111-119 (2004).
- Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (6), 2979-2984 (1998).
- Fahrenbach, J. P., Ai, X., Banach, K. Decreased intercellular coupling improves the function of cardiac pacemakers derived from mouse embryonic stem cells. J Mol Cell Cardiol. 45 (5), 642-649 (2008).
- Yan, J., et al. c-Jun N-terminal kinase activation contributes to reduced connexin43 and development of atrial arrhythmias. Cardiovasc Res. 97 (3), 589-597 (2013).
- White, S. M., Constantin, P. E., Claycomb, W. C. Cardiac physiology at the cellular level: use of cultured HL-1 cardiomyocytes for studies of cardiac muscle cell structure and function. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), H823-H829 (2004).
- Yang, Z., Shen, W., Rottman, J. N., Wikswo, J. P., Murray, K. T. Rapid stimulation causes electrical remodeling in cultured atrial myocytes. J Mol Cell Cardiol. 38 (2), 299-308 (2005).
- Brundel, B. J., Kampinga, H. H., Henning, R. H. Calpain inhibition prevents pacing-induced cellular remodeling in a HL-1 myocyte model for atrial fibrillation. Cardiovasc Res. 62 (3), 521-528 (2004).
- Umapathy, K., et al. Electrogram fractionation in murine HL-1 atrial monolayer model. Heart Rhythm. 5 (7), 1029-1035 (2008).
- Fast, V. G., Cheek, E. R. Optical mapping of arrhythmias induced by strong electrical shocks in myocyte cultures. Circ Res. 90 (6), 664-670 (2002).
- Bayly, P. V., et al. Estimation of conduction velocity vector fields from epicardial mapping data. IEEE Trans Biomed Eng. 45 (5), 563-571 (1998).
