Dorsale rotganglier (DRG) er strukturer som inneholder de sensoriske neuroner i det perifere nervesystem. Når dissosiert, kan de være ko-dyrket med SC-lignende adipose-avledede stamceller (ASC), som gir en verdifull modell for å studere in vitro nerve regenerering og myelinisering, etterligne in vivo miljøet på skadestedet.
Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.
Perifere nerveskader er vanlig med ca 9.000 tilfeller i Storbritannia forekommer hvert år i en overveiende unge og yrkesaktive befolkningen en. Til tross for mikro nerve reparasjonsteknikker, er normal restaurering av funksjon uoppnåelig med påfølgende svekket hånd følelse, nedsatt motorikk og hyppig smerte og kulde intoleranse to. Slike skader har en dyp og varig innvirkning på pasienten og deres evne til å utføre dagliglivets aktiviteter, med mindre enn 60% tilbake i jobb tre.
Etter skade, fenotype og morfologi av nevroner og Schwannske celler (SC) endring for å skape et egnet miljø for å tillate axon spiring. Ved transeksjon, blir delt inn i nerven proksimale og distale stumper; proksimale stump være det punktet hvor den regenerative prosessen foregår, mens den distale stump gjennomgår Wallerian degenerasjon hvorpå SC løsnefra den skadde axoner, de-differentiate og sprer. Dette er grunnleggende mot fjerning av myelin rusk og forberede distal stubbe for nerve re-generasjon 4,5. Axon spirende støttes av produksjonen av neurotrofe faktorer og chemokiner utgitt av SC på distal stubbe, og ledet av basal lamina etterlatt følgende Wallerian degenerasjon 6,7. SC justere langs regenererende axon danner bånd Büngner, som hjelpemiddel axon vekst mot målet organ, redusere forgrening utenfor endoneurial tube. Etter reinnervation, SC danne ny myelin skjede innpakning regenererte aksoner, men sensorisk og motorisk funksjon er bare delvis restaurert 8.
Ryggmargen (DRG) er strukturer som ligger i mellomvirvelforamina av ryggsøylen, som inneholder de sensoriske nervecellene innervating de perifere organer. Når dissosiert, kan de brukes som en egnet in vitro model for studiet av nerve regenerering 9 – 11, inkludert undersøkelser av myelin dannelse. Spesielt voksen DRG neuroner etterligne in vivo-egenskapene til disse celler, og gir et utmerket verktøy for å studere nye strategier for perifer nervereparasjon i vevsteknologi.
Ko-kulturer representerer et dynamisk system som simulerer in vitro samspillet mellom to (eller flere) celletyper på en bestemt in vivo miljø. En av fordelene med disse celle ko-kulturmodeller er fleksibilitet og høy kontroll som kan utøves på det ekstracellulære miljø. DRG-neuroner har vært brukt hyppigst i ko-kultursystemer med SC for å etterligne de faktiske interaksjoner som forekommer mellom de to celletyper i det perifere nervesystemet 10,12 – 14. Det ble demonstrert at SC utskiller ekstracellulær matriks (ECM) proteiner og vekstfaktorer som kan gi vesentlig bedreevne til DRG nevroner å overleve og spire neuritter 15,16. Imidlertid SC krever lange tidsperioder for å proliferere og, til tross for fremskrittene i cellekultur teknikk, er det fremdeles vanskelig å generere et passende antall celler for vev tekniske anvendelser. I tillegg er offer for en sunn nerve nødvendig å høste autolog SC. Derfor er forskjellen i sourcing SC viktig for både tissue engineering og in vitro testing av nerve regenerering. I dette vis, kan ASC betraktes som en verdifullt alternativ for utvikling av et vev-konstruert konstruksjon som skal brukes for perifer nervereparasjon 17,18. Tidligere arbeid demonstrert evnen til disse cellene til å differensiere til SC-lignende ASC, uttrykker karakteristiske glial-markører, slik som S-100, p75 og glial fibrillært surt protein (GFAP) 19, så vel som myelin protein null (P0) 20 . Utskillelsen av glial vekstfaktorer, slik som hjerne-avledet neurotrofisk faktor (BDNF), ble også observert nervevekstfaktor (NGF) og glial celleavledet neurotrofisk faktor (GDNF) 21,22. Derfor kan SC-lignende ASC benyttes som promotor av perifere nerve regenerering, som vist ved både in vitro og in vivo studier 23-26. I tillegg kan ASC høstes gjennom minimalt invasive prosedyrer på høyere antall i forhold til andre stammecelletyper; frekvens av stamceller i fettvev er 100- til 1000-ganger høyere enn i benmargen 27, og de har en høyere spredningshastighet i forhold til SC og benmarg mesenchymale stamceller.
Dette arbeidet tar sikte på å gi en detaljert protokoll for å utføre høyeffektive høsting av dissosiert DRG nevroner og ASC henholdsvis, sistnevnte blir differensiert i SC-lignende celler. Den ko-kultur av disse to celletyper vil derfor gi en meget praktisk system som kan brukes for fremtidige studier på evnen av DRG neurons å spire neuritter og mekanismene for myelin formasjon på forskjellig stillas for nerve tissue engineering.
DRG nevroner er hyppig brukt blant nevronale celler for primær kultur for å studere regenerering av nevroner etter aksotomi in vivo. Her en nøyaktig protokoll for DRG høste fra voksne rotter er presentert, med sikte på å redusere bestanden av satellittceller i omgivelsene uten å ødelegge neuronoverlevelse. Som ASC differensiert i et SC-lignende fenotype er en gyldig alternativ til SC for celleterapier, er en SC-lignende ASC / DRG ko-kultur-system også beskrevet i detalj.
Det er allment kjent at laminin (eller laminin-avledet peptidsekvenser) har en gunstig effekt på neuron overlevelse og neurite dannelse 31-33. Når du utfører DRG nevroner kulturer det er derfor anbefalt å tidligere frakk hver underlaget med laminin for å unngå tap av funksjonalitet av nerveceller. Konseptet med laminin belegg gjelder også biomateriale substrater for utforming avvevsteknologi konstruksjoner, så som poly – kaprolakton (PCL) brukes ofte for fabrikasjon av nerve ledningene 30. Også, demonstrerte tidligere arbeid som fibrin matriser er egnede materialer for nevronale kulturer i tre dimensjon 11.
I tillegg til proteinbelegg, ko-kulturmodeller gi verdifulle forhold for DRG neuron overlevelse og et egnet miljø for å studere interaksjoner som forekommer mellom nevroner og SC i det perifere nervesystemet etter skade. Celler kan også bli transplantert in vivo ved bruk av nevrale enhetene for å forkorte den tid rekruttering av autologe celler ved skadestedet. Dette er spesielt viktig i alvorlige skader, som kan føre til celle senescens / død og muskelatrofi. Selv SC er de viktigste gliaceller som er involvert i prosessen med perifer nerveregenerering og myelinisering, deres begrensede tilgjengelighet og deres sakte proliferasjonsrate gjør dem uegnetfor tissue engineering applikasjoner 34. ASC er et gyldig alternativ på grunn av sin overflod og evne til å differensiere i SC fenotype, uttrykker spesifikke gliale markører og viser funksjonelle likheter til innfødte SC 19. ASC er også i stand til å produsere proteiner og vekstfaktorer 5 som kan være fordelaktig for dannelse og utvidelse av neuritter av DRG-neuroner i en ko-kultur-system. Imidlertid kan to forskjellige ko-kultursystemer settes opp som funksjon av de eksperimentelle behov. Det foreslås i denne utredningen metoden er en revidert versjon av et veletablert protokollen i vårt laboratorium 11, og det innebærer en direkte kontakt mellom de to celletypene (direkte co-kultur), der den andre celletype (DRG nevroner) sås på toppen av de andre (SC-lignende ASC). Denne metode er basert på tidligere funn som viste viktigheten av tilstedeværelsen av en glial cellelaget på substratet ved såing nevronkulturer 35 <sup> – 37. Denne effekten er sannsynligvis på grunn av celle-celle interaksjoner gjennom DRG-integriner og ECM-molekyler deponert fra ASC og andre signaler på stammen celleoverflaten. Det ble også observert at en reduksjon av serum-protein i mediet redusert spredning av forurensende satellittceller som kan utlede fra dissosiasjonen av DRG-neuroner, uten å påvirke ASC funksjoner. Imidlertid satellittcellene, inkludert en liten populasjon av SC, er vanskelig å fullstendig eliminere fra kulturer av DRG-neuroner og få gjenværende celler vil også være tilstede i ko-kultur-system. Det er derfor viktig å merke seg at disse små undergrupper kan også delta i myelination prosesser under in vitro-studier, minner de autologe celler som er til stede in vivo etter skade. Den andre tilnærmingen (ikke vist her) innebærer bruk av cellekulturinnsatser, unngår en direkte kontakt mellom de to forskjellige celletyper (indirekte ko-kultur). However, er det ikke er representative for de in vivo-forhold under nerve regenerering (redusert evne til nerveceller for å utvikle lange neuritter), men det blir brukt til å undersøke effekten av frigitte faktorer, bærerdiffunderbare i mediet ved en bestemt cellepopulasjon på det andre 38 .
The authors have nothing to disclose.
This work is supported by the National Institute for Health Research, Academy of Medical Sciences and the British Society for Surgery of the Hand. We also gratefully acknowledge the continuing supply of GGF-2 from Acorda Therapeutics, USA. The authors would finally like to acknowledge Prof. Giorgio Terenghi for his valuable support and guidance in our group over the past years that led to the development and optimization of this protocol.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
100 µm cell strainer | BD Biosciences | 352360 | 70 μm strainers (ref. 352350) can be used as alternative |
15 mL plastic tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
50 mL plastic tubes | Sarstedt | 62.547.004 | |
75 cm2 flasks | Corning | BC301 | |
Retinoic Acid >98% HPLC | Sigma | R2625 | |
ARA-C supplement | Sigma | C6645 | |
Recombinant Human FGF-basic (154 aa) | Peprotech | 100-18B | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9205 | |
Collagenase type I | Gibco | 17100-017 | Note: this collagenase is only used for fat tissue digestion |
Collagenase type IV | Worthington Biochemical | LS004188 | Note: this collagenase is only used to dissociate DRG explants |
Foetal Bovine Serum (FBS) | Biosera | FB-1001 | |
Forskolin | Sigma | F3917 | |
Glass pipettes | Fisher Scientific | FB50253 | Sharp material to be disposed accordingly |
Glial Growth Factor-2 (GGF-2) | Acorda Therapeutics | GGF-2 was kindly donated by Acorda Therapeutics. For a commercially available alternative, we recommend NRG1-β1 (R & D Systems, Abingdon) for stem cell differentiation to be used at the final concentration of 200ng/ml | |
Nutrient Mix F12 HAM | Sigma | N6658 | Warm at 37 °C in a water bath unless specified |
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma | H9394 | Warm at 37 °C in a water bath unless specified |
N-2 supplement (100x) | Invitrogen | 17502 | |
Nerve Growth Factor 2.5s Protein, Mouse Submaxillary Glands (NGF) | Millipore | NC011 | |
Penicillin-Streptomycin (PS) | Sigma | P0781 | |
Petri dishes | Corning | 430165 | |
Recombinant Human PDGF-AA | Peprotech | 100-13A | |
Trypsin | Invitrogen | 25200-056 | Warm at 37 °C in a water bath. This is used for cell detachment from tissue culture flasks |
Trypsin (2x bovine pancreatic) | Worthington Biochemical | LS003703 | This is used for DRG dissociation |
Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Sigma | M8042 | Warm at 37 °C in a water bath unless specified |
2-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Prepare the solution in the biological cabinet |