माउस hippocampal ऊतक के पूर्व utero Electroporation और Organotypic स्लाइस संस्कृति
Summary
Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.
Abstract
Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.
Introduction
हिप्पोकैम्पस एक स्मृति और सीखने में महत्वपूर्ण भूमिका के रूप में अच्छी तरह से भावनात्मक व्यवहार निभाता है। एक मुख्य समारोह तंत्रिका तंत्र के उच्च plasticity की आवश्यकता है, जो लंबे समय तक याद में अल्पकालिक स्मृति के समेकन, के होते हैं। हिप्पोकैम्पस के दांतेदार गाइरस इनपुट जानकारी के लिए प्राथमिक प्रवेश द्वार के रूप में कार्य करता है और वयस्कता 1,2 भर में भी चल रही न्यूरोजेनेसिस के साथ दो मस्तिष्क क्षेत्रों में से एक है। हिप्पोकैम्पस संरचना का विकास देर से embryogenesis दौरान और विशेष रूप से पहले 3 से 4 सप्ताह के प्रसव के बाद 3 के दौरान होता है। दांतेदार के प्रारंभिक विकास के दौरान एक स्टेम सेल पूल वयस्क न्यूरोजेनेसिस 4 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रसव के बाद के लिए आवश्यक की स्थापना की है गाइरस। विकासशील न्यूरॉन्स प्रसव के बाद के रूप में अच्छी तरह से वयस्क न्यूरोजेनेसिस दौरान अपरिपक्व और अंत में परिपक्व न्यूरॉन को पूर्वज कोशिकाओं के कई चरणों के माध्यम से स्टेम सेल से, विभिन्न चरणों के माध्यम से गुजरती हैं। न्यूरोजेनेसिस की अभिव्यक्ति के विभिन्न चरणों मेंविशिष्ट जीन हिप्पोकैम्पस circuitry के 5,6 में परिपक्वता और नए न्यूरॉन्स के एकीकरण की अनुमति देने के लिए आवश्यक है।
इन जीनों में से कई की अभिव्यक्ति पैटर्न और समारोह को परिभाषित करने की अनुमति दी माउस आनुवंशिकी और immunohistochemistry द्वारा phenotype के विश्लेषण के साथ ही आणविक विधियों का प्रयोग। इसके अलावा माइक्रोएरे विश्लेषण के रूप में अच्छी तरह से chromatin immunoprecipitation (चिप) में संभावित प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष रूप से लक्ष्य जीन 7,8 के बारे में जानकारी प्रदान की। हालांकि, दांतेदार गाइरस के विशेष विकास में हिप्पोकैम्पस के विकास के लिए नियामक तंत्र के विषय में कई खुला सवाल है, वहाँ अब भी कर रहे हैं। नीचे से या ऊपर-विनियमन ब्याज और / या अपने लक्ष्य जीन और विकास के दौरान उनके भाग्य का पालन के जीन की विशिष्ट जीन कोशिकाओं की एक छोटी संख्या के हेरफेर की अनुमति के लिए आवश्यक है एक प्रणाली विनियमित रहे हैं कि कैसे आगे जानकारी हासिल करने के लिए। Utero electroporation में shRNAs, ब्याज या रचनात्मक recombina के जीन की सीडीएनएएसई इस तरह के एक उपकरण प्रदान करता है। Electroporation के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए वांछित डीएनए या छोटे RNAs अभिव्यक्ति plasmids की उपस्थिति सुनिश्चित करने के लिए। यह दृष्टिकोण बहुत सफलतापूर्वक कारण गहरी मस्तिष्क परतों में हिप्पोकैम्पस संरचनाओं की स्थिति के लिए दांतेदार गाइरस के विकास की जांच के लिए एक अधिक चुनौतीपूर्ण दृष्टिकोण कॉर्टिकल विकास 9,10 अध्ययन में लागू किया, लेकिन है।
Organotypic टुकड़ा संस्कृति द्वारा पीछा पूर्व utero electroporation के इस समस्या 11,12 नाकाम करने के लिए एक दृष्टिकोण है। के विपरीत utero electroporation के नहीं पूरे भ्रूण लेकिन केवल सिर इसलिए हिप्पोकैम्पस और दांतेदार गाइरस की ओर shRNA / डीएनए निर्देशित करने के लिए एक और अधिक अनुकूल रास्ते में इलेक्ट्रोड जगह करने की अनुमति के लिए किया जाता है में। हमारे समूह सफलतापूर्वक दांतेदार गाइरस विकास 8 दौरान प्रतिलेखन कारक Bcl11b की भूमिका का अध्ययन करने के पूर्व utero electroporation के कार्यरत हैं। Bcl11b आर द्वारा दांतेदार गाइरस विकास में एक दोहरी भूमिका हैimmunohistochemistry के द्वारा प्रदर्शन किया गया के रूप में पूर्वज सेल प्रसार के साथ-साथ भेदभाव egulating। आगे इन प्रक्रियाओं में Bcl11b भागीदारी के लिए एक तंत्र को परिभाषित करने के लिए, Polleux समूह 11,12 के प्रोटोकॉल प्रोटोकॉल अनुभाग में नीचे वर्णित के रूप में दांतेदार गाइरस अध्ययन करने के लिए समायोजित किया गया। पहली बार एक दृष्टिकोण में सवाल Bcl11b स्वायत्त neuronal सेल भेदभाव सेल को विनियमित किया जाता है कि क्या संबोधित किया। एक दूसरा दृष्टिकोण Desmoplakin, Bcl11b का एक सीधा लक्ष्य जीन, Bcl11b phenotype के बचाव के लिए पर्याप्त है कि क्या जांच की।
Protocol
Representative Results
Discussion
हिप्पोकैम्पस सीखने और स्मृति में एक महत्वपूर्ण कार्य किया है। दांतेदार गाइरस भी न्यूरोजेनेसिस विकास के दौरान, लेकिन यह भी वयस्कता भर में न केवल तब होता है, जहां दो मस्तिष्क क्षेत्रों में से एक है। प्र?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Deutsche Forschungsgemeinschaft to SB (BR-2215; SFB 497/A9).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| Flaming/ Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments Company (USA) | P-97 | |
| Fine Glass Pipettes | Warner Instruments | G100F-4 | |
| Microgrinder | Narishige, Japan | EG-44 | |
| Anesthetic Bracket unit | Harvard Apparatus | PY2 34-0412 | |
| Halovet Vaporizer | Harvard Apparatus | PY2 34-0398 | |
| Fluovac System | Harvard Apparatus | PY2 34-0387 | |
| IMS Fluosorber | Harvard Apparatus | PY2 34-0415 | |
| Anesthetizing Chamber | Harvard Apparatus | PY2 34-0460 | |
| Electroporator | BEX Company | CUY21 EDIT | |
| Tweezers with disk electrodes | BEX Company | LF650P3 | 3 mm electrodes for E15.5 |
| Tweezers with disk electrodes | BEX Company | LF650P5 | 5 mm electrodes for E18.5 |
| Picospritzer III | Parker Hannifin Corporation | P/N 052-0500-900 | |
| HM 650V Vibrating Blade Microtome, 230V | Thermo Scientific | 920120 | |
| Dissection Microscope | Carl Zeiss Microscopy Gmbh | Stemi SV8 | |
| Inverted Microscope | Leica | Leica DM IL LED | |
| Confocal Microscope | Leica | Sp5II | |
| 6 well dish | BD Falcon | #353502 | |
| 6 well dish | CELLSTAR | #657160 | |
| Tissue culture inserts | BD Falcon | #353090 | |
| Fast Green | Sigma | F7252 | |
| Laminin | Sigma | #L2020 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | #P5899 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Forceps | Dumont #55 | 11255-20 Inox | |
| HBSS 10X | Life Technology | 14180-046 | |
| BME | Life Technology | 41010-26 |
Riferimenti
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