Экс Utero электропорации и Органотипической фрагмент Культура мыши ткани гиппокампа
Summary
Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.
Abstract
Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.
Introduction
Гиппокамп играет важную роль в памяти и обучения, а также эмоциональное поведение. Один основная функция состоит в консолидации кратковременной памяти в долговременную память, которая требует высокой пластичности нервной системы. Зубчатая извилина гиппокампа выступает в качестве основного шлюза для ввода информации, а также один из двух областей мозга с постоянной нейрогенеза в течение взрослой жизни 1,2. Развитие гиппокампа структуры происходит во время позднего эмбриогенеза и особенно в течение первого 3 до 4 недель послеродового 3. Во время раннего развития зубчатой извилине пул стволовых клеток, учрежденного требуется для послеродового а также нейрогенез 4. Развивающиеся нейроны пройти через различные этапы, из стволовой клетки через несколько этапов клеток-предшественников в незрелые и, наконец, зрелого нейрона во время послеродового а также нейрогенез. На разных этапах нейрогенеза экспрессияспецифические гены требуется, чтобы созревание и интеграции новых нейронов в гиппокампе схемы 5,6.
Использование генетику мыши и анализ фенотипа с помощью иммуногистохимии, а также молекулярные методы позволили определить характер экспрессии и функции многих из этих генов. В дополнение анализа микрочипов, а также иммунопреципитации хроматина (чип) представил информацию о потенциальных прямых и косвенных генов-мишеней 7,8. Тем не менее, есть еще много открытых вопросов, касающихся механизмов регуляции гиппокампа развития, в частности развития зубчатой извилины. Чтобы получить более глубокое представление, как специфические гены регулируются систему требуется позволяя манипулировать небольшим количеством клеток ВНИЗ или повышающей регуляции гена интереса и / или его генов-мишеней и следить за их судьбу во время разработки. Внутриутробное электропорации из shRNAs, кДНК генов интересов или Cre рекомбинацииSE обеспечивает такой инструмент. В целях обеспечения присутствия плазмиды экспрессии нужной ДНК или малых РНК должны использоваться для электропорации. Этот подход очень успешно применяется в изучении развития коры 9,10, но более сложные подходы, изучения развития зубчатой извилине из-за позиции гиппокампа структур в более глубоких слоях мозга.
Экс маточно электропорации с последующим органотипической культуры среза, является одним из подходов, чтобы обойти эту проблему 11,12. В отличие от внутриутробного электропорации не весь эмбриона, но только головка используется позволяя таким образом, чтобы поместить электроды в более выгодном образом, чтобы направить shRNA / ДНК в сторону гиппокампа и зубчатой извилины. Наша группа успешно применяются экс внутриутробно электропорации для изучения роли фактора транскрипции Bcl11b во зубчатой развития извилины 8. Bcl11b имеет двойную роль в зубчатой извилине развития на гegulating пролиферацию клеток-предшественников, а также дифференцировку как было показано с помощью иммуногистохимии. Для дальнейшего определения механизма участия Bcl11b в этих процессах, протоколы группы Polleux 11,12 доводили до изучения зубчатой извилине, как описано ниже в разделе протокола. В первом приближении вопрос был рассмотрен Bcl11b регулирует ли нейронов дифференциации клеток клеточно автономно. Второй подход рассматривается ли Desmoplakin, непосредственным объектом ген Bcl11b, достаточно, чтобы спасти фенотип Bcl11b.
Protocol
Representative Results
Discussion
Гиппокамп играет важную роль в процессах обучения и памяти. Зубчатая извилина также является одним из двух областей мозга, где нейрогенез происходит не только во время разработки, но и во всей взрослой жизни. Послеродовая и взрослых гиппокампа нейрогенеза происходит в аналогичным обр?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Deutsche Forschungsgemeinschaft to SB (BR-2215; SFB 497/A9).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| Flaming/ Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments Company (USA) | P-97 | |
| Fine Glass Pipettes | Warner Instruments | G100F-4 | |
| Microgrinder | Narishige, Japan | EG-44 | |
| Anesthetic Bracket unit | Harvard Apparatus | PY2 34-0412 | |
| Halovet Vaporizer | Harvard Apparatus | PY2 34-0398 | |
| Fluovac System | Harvard Apparatus | PY2 34-0387 | |
| IMS Fluosorber | Harvard Apparatus | PY2 34-0415 | |
| Anesthetizing Chamber | Harvard Apparatus | PY2 34-0460 | |
| Electroporator | BEX Company | CUY21 EDIT | |
| Tweezers with disk electrodes | BEX Company | LF650P3 | 3 mm electrodes for E15.5 |
| Tweezers with disk electrodes | BEX Company | LF650P5 | 5 mm electrodes for E18.5 |
| Picospritzer III | Parker Hannifin Corporation | P/N 052-0500-900 | |
| HM 650V Vibrating Blade Microtome, 230V | Thermo Scientific | 920120 | |
| Dissection Microscope | Carl Zeiss Microscopy Gmbh | Stemi SV8 | |
| Inverted Microscope | Leica | Leica DM IL LED | |
| Confocal Microscope | Leica | Sp5II | |
| 6 well dish | BD Falcon | #353502 | |
| 6 well dish | CELLSTAR | #657160 | |
| Tissue culture inserts | BD Falcon | #353090 | |
| Fast Green | Sigma | F7252 | |
| Laminin | Sigma | #L2020 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | #P5899 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Forceps | Dumont #55 | 11255-20 Inox | |
| HBSS 10X | Life Technology | 14180-046 | |
| BME | Life Technology | 41010-26 |
Riferimenti
- Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).
- Frotscher, M., Zhao, S., Forster, E. Development of cell and fiber layers in the dentate gyrus. Prog Brain Res. 163, 133-142 (2007).
- Muramatsu, R., Ikegaya, Y., Matsuki, N., Koyama, R. Neonatally born granule cells numerically dominate adult mice dentate gyrus. Neuroscienze. 148, 593-598 (2007).
- Li, G., Pleasure, S. J. Morphogenesis of the dentate gyrus: what we are learning from mouse mutants. Dev Neurosci. 27, 93-99 (2005).
- Hsieh, J. Orchestrating transcriptional control of adult neurogenesis. Genes Dev. 26, 1010-1021 (2012).
- Li, G., Pleasure, S. J. Genetic regulation of dentate gyrus morphogenesis. Prog Brain Res. 163, 143-152 (2007).
- Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Mol Biotechnol. 45, 87-100 (2010).
- Simon, R., et al. A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis. Embo J. 31, 2922-2936 (2012).
- Pilaz, L. J., Silver, D. L. Live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex. J Vis Exp. (88), (2014).
- Pacary, E., et al. Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation. J Vis Exp. (65), (2012).
- Hand, R., et al. Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex. Neuron. 48, 45-62 (2005).
- Polleux, F., Ghosh, A. The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development. Sci STKE. (136), 19 (2002).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. J Vis Exp. (2), (2007).
- Sugiyama, T., Osumi, N., Katsuyama, Y. The germinal matrices in the developing dentate gyrus are composed of neuronal progenitors at distinct differentiation stages. Dev Dyn. 242, 1442-1453 (2013).
- Lechler, T., Fuchs, E. Desmoplakin: an unexpected regulator of microtubule organization in the epidermis. J Cell Biol. 176, 147-154 (2007).
- Nichols, A. J., O’Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development. J Vis Exp. (74), (2013).
