Post-transkripsiyonel ayarlı genlerin kimyasal Modülatörler için yüksek verimli tarama
Summary
Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3’ UTR.
Abstract
Transkripsiyonel ve transkripsiyon sonrası düzenleme Her iki genlerin ifadesi üzerinde derin bir etkiye sahip. Ancak, yaygın olarak kabul edilen hücre tabanlı tarama deneyleri esas promotör hedefleme moleküllerinin belirlenmesi amaçlı olan, transkripsiyonel regülasyonu odaklanmak. Sonuç olarak, transkripsiyon sonrası mekanizmalar büyük ölçüde gen ifadesi hedeflenen ilaç gelişimi ile ortaya edilmektedir. Burada ve değiştirmek mümkün bileşiklerin belirlenmesi onun mRNA kaderi modülasyonunda 3 'çevrilmemiş bölge (3' UTR) rolünü araştırmak amacıyla bir hücre bazlı deney tarif eder. Deney kararlı bir şekilde hastalığa, ilgili hücre hattına entegre ilgi konusu bir genin 3 'UTR içeren bir lusiferaz raportör yapının kullanımına dayanmaktadır. Protokol tedavi 24 saat sonra lusiferaz aktivitesi etkileyen moleküllerin tanımlanması amaçlı birincil tarama başlangıç odaklanarak, iki parçaya ayrılmıştır. protokolün ikinci bölümüaçıklar karşı tarama özellikle 3 'UTR ile lusiferaz aktivitesini modüle bileşikleri ayırmak için gerekli. Ayrıntılı protokol ve temsil sonuçlarına ek olarak, biz tahlil geliştirme ve endojen hedefe isabet (ler) doğrulama konusunda önemli hususlar sağlamaktadır. tarif edilen hücre bazlı bir raportör gen deneyi bilim adamları 3 'UTR bağımlı transkripsiyon sonrası mekanizmalar yoluyla protein seviyelerini modüle molekülleri tanımlamak için izin verecektir.
Introduction
Gen ifadesinin uzun bir süre transkripsiyonel düzenleme için protein üretimini kontrol açık olmayan rolü ise önemli bir oynadığı düşünülmektedir edildi. Giderek artan kanıtlar, bununla birlikte, transkripsiyon sonrası düzenleme hücresel protein bolluğu 1,2 belirlemek için olduğu kadar, eğer değilse, transkripsiyonel düzenleme daha fazla katkı göstermektedir. Gen ifadesinin transkripsiyon sonrası kontrol ilk düşünce oldu çok daha karmaşık ve ayrıntılı. Aslında, post-transkripsiyonel kontrol tüm çeşitli aşamalarında mRNA işleme, lokalizasyonu, ciro, çeviri 3 gibi yeni açıklanan geri dönüşümlü RNA metilasyon 4 olmak üzere, düzenlendiği ortaya çıktı. Transkripsiyon sonrası düzenleme olan bir dizi işlem potansiyel olarak etkilenen kaynaktan deney aşağıda tarif edilen mRNA'nın 3 'çevrilmemiş bölge (3' UTR) yer aldığı, bu odaklanmaktadır. 3 'UTR geniş RNA bağlayıcı pr belirli etkileşim yoluyla esas mRNA kaderi etkilerdüzenleyici dizileri ve / veya ikincil yapılar 5 oteins ve kodlayıcı olmayan RNA'lar. Bu nedenle, bu etkileşimleri değiştirebilir veya yukarı sinyal iletim yollarında engel küçük moleküller, protein bolluğu düzenleyen dengeyi kayacak. Bu tedavi yaklaşımı olan bir kanıt, hastalık-ilgili genler, bu şekilde farmakolojik müdahale için potansiyel bir hedef temsil etmektedir post transkripsiyonel düzenlenmesinde tabi olduğunu gösteren Varlığından insan patolojilerinin için özel bir önem taşımaktadır. Bu nedenle, yüksek verimli bir formatta transkripsiyon sonrası kontrol mekanizmaları ile girişim ile mRNA düzeyleri 'modülatörlerinin taranması için izin sistemleri, potansiyel yeni tedavi tanımlanmasında değerli araçlar olabilir.
tarif edilen hücre bazlı bir raportör gen deneyi ile 3 'UTR bağlı mekanizmalar yoluyla mRNA'nın kaderi modüle edebilirler bileşiklerin tanımlanmasına izin verir. Birçok ana c oluşmaktadıromponents (Şekil 1) ve birkaç ön adım gerektirir tahlil fizibilite doğrulamak için. Her şeyden önce, raportör yapı, söz konusu geninden 3 'UTR içerecek şekilde tasarlanmıştır. 3 'UTR, örneğin ateşböceği lusiferaz (Şekil 1) gibi bir raportör genin ucuna kaynaştırılır. Takılı 3 'UTR ile uygulanan transkripsiyon sonrası kontrol mekanizmalarının herhangi bir değişiklik, çeşitli lusiferaz seviyelerinde elde edilen bu kimerik transkripti stabilitesini ve / veya translasyon etkinliğini değiştirir. Bu nedenle, lüsiferaz faaliyetindeki değişimler de ilgi konusu genin, etkilenen transkripsiyon sonrası düzenleme dolaylı ölçü vermektedir. sisteminin ikinci bileşeni, bir kontrol raportör yapı, aynı haberci genini tanımlayan fakat herhangi bir 3 'UTR içermeyen benzer bir sentezleme plazmiddir. İki raportör plasmidleri, geleneksel moleküler biyoloji protokollerini kullanarak laboratuarda tasarlanmış ya da ticari kaynaklardan satın alınabilir.
bir hücre sırasına seçimi deney yapımı için kritik önem taşır. Hangi hücre hattı optimum model kullanılabilirlik, transfectability ve büyüme özellikleri gibi sadece pratik konulara patolojiye maksimum benzerlik gibi klinik gereksinimlerine kadar pek çok faktöre bağlıdır. Önemlisi, önce bir raportör gen 3 'UTR füzyon kimerik transkript düzeyinde beklenen etkiye sahip olduğundan emin olmalısınız devam etmek. 3 lusiferaz sinyali anlamlı fark olmaması alternatif olanlar arama için isteyen, UTR bu hücresel modelde işlevsel değil 'UTR taşıyan ve kontrol muhabiri geçici 3 belirtmek istiyorum seçilen hücrelerde transfekte yapılarını'. Yüksek işleme kapasiteli bir düzende, 3 'UTR taşıyan ve kontrol lusiferaz raportör yapılan ile kararlı bir şekilde seçilen bir hücre dizisindeki entegre edilmelidir. Kullanarak stabil bir şekilde geçici olarak üzerinde entegre transfekteHücre hattı, çeşitli nedenlerden dolayı tercih edilir. Bu maliyetleri azalır, transfeksiyon verimliliği hareketlerinden kaynaklanan veri değişkenliği azaltmak, zor transfect hücre hatları da dahil olmak üzere bir hücresel modelin seçimi genişletmek olacaktır. Ayrıca, geçici transfeksiyon hücreleri üzerine çok sık sistemin doygunluk giden bir DNA plazmid ile aşırı yük. Bu şartlarda raportör ekspresyonu daha fazla bir artışın potansiyel regülasyonunda bileşiklere karşı duyarlılık azalmasına neden zor olabilir.
Tüm tahlil bileşenleri kurmak zaman lusiferaz aktivite gerçekten yukarı ve aşağı-regüle '3 takılı yoluyla özellikle olabilir Son olarak, bu deneyde, yani fizibilitesini belirlemek için yüksek verimli formatına geçmeden önce kritik UTR. iyi kontrol ilgi 3 'UTR ile mRNA stabilitesini veya çevrilebilirlik modüle etmek için rapor küçük moleküller olacaktır. Bu sahip isemümkün değil, istenen etkiyi taklit vekil kontroller kabul edilir. Bu miRNA'ların veya ilgi 3 'UTR bağlanma yoluyla etkilere neden olduğu bilinmektedir, RNA bağlanan proteinleri olabilir. Bu tür kontrollerin değerlendirilmesi primer tarama geliştirilen testin işlevselliğini gösterir, aynı zamanda yüksek verimli biçimde dinamik aralık, hassasiyet ve performans tahmini için izin verir sadece daha önce.
Açıklanan protokol kullanarak biz 2.000 bileşik kütüphane 6 gösterildi. Nöroblastom, bebeklik en sık ekstrakraniyal solid tümör, bir biyolojik model olarak kullanıldı ve amplifikasyon MYCN onkogen, 3 'UTR güçlü bir hedef genin 7 olarak nöroblastom olumsuz sonuç, tahmin. 2 deneysel düzen özetliyor Şekil. Tarama bir seferde elenmiş 27 plaka toplu boyutu ile üç aşamada bölündü. 27 plakaları toplu Spektrum Koleksiyonu kütüphane dahilPlakalar n.1-n.8 + n.25 (ilk çalıştırma), n.9-n.16 + n.25 (ikinci dönem) ve n.16-n.24 + n.25 (üçüncü dönem), her plaka üç nüsha olarak tarandı. Böylece, bir kütüphane plakası (n.25) mümkün arası çalışma karşılaştırma yapma üç çalışır içerisinde test edildi. protokol aşağıda üç kopya halinde test edilen 9 kütüphane tabakalarından tek bir çalışma açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
This protocol describes a cell-based reporter-gene assay aiming at the identification of modulators that target 3’ UTR-dependent post-transcriptional processes. It encompasses the primary screening and the counter-screen and, if needed, can be accompanied by a cytotoxicity assay. The outcome of the primary screening is a number of valuable candidate compounds, whose reproducibility and specificity is further validated in the counter-screening.
The identification of primary hits is based …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Italian Neuroblastoma Foundation for the full financial support to this project.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Culture plate 96-well White | PerkinElmer | 6005688 | |
| StorPlate 96-well U bottom (dilution plate) | PerkinElmer | 6008190 | |
| 100 ml disposable trough for reagents | Tecan | 10 613 048 | |
| 300 ml disposable robotic reservoir | VWR | PB12001301 | |
| Robot tips DITI 50μL Sterile | Tecan | 30038607 | |
| Robot tips DITI 200μL Sterile | Tecan | 30038617 | |
| Matrix 1.4 ml 2D Barcoded w, Flat Bottom Tubes | Thermo Scientific | 3711 | |
| ONE-Glo Luciferase Assay System | Promega | E6120 | |
| RPMI | Lonza | BE12-918F | |
| PBS-1X, w/o Ca++, Mg++ | Lonza | BE17-516F | |
| L-Glutamine 200mM | Lonza | BE17-605E | |
| FBS | Lonza | DE14-801F | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| The Spectrum collection (compound library) | MicroSource Discovery Systems | N/A | |
| Tecan Freedom EVO200 robot | Tecan | N/A | |
| Tecan F200 multiplate reader | Tecan | N/A |
Riferimenti
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13 (1), 220 (2012).
- Mitchell, S. F., Parker, R. Principles and properties of eukaryotic mRNPs. Mol. Cell. 54 (4), 547-558 (2014).
- Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation. Nat. Rev. Genet. 15 (5), 293-306 (2014).
- Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. The role of the 3’ untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells. RNA Biol. 9 (5), 563-576 (2012).
- Sidarovich, V., Adami, V., Quattrone, A. A Cell-Based High-Throughput Screen Addressing 3’ UTR-Dependent Regulation of the MYCN Gene. Mol. Biotechnol. 56 (7), 631-643 (2014).
- Cheung, N. -. K. V., Dyer, M. A. Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy. Nat. Rev. Cancer. 13 (6), 397-411 (2013).
- Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br. J. Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
- Herbst, J., et al. Multiplexing a high-throughput liability assay to leverage efficiencies. Assay Drug Dev. Techn. 7 (3), 294-303 (2009).
- van Olst, E. S. i. e. b. r. i. n. g. -., et al. Affordable luciferase reporter assay for cell-based high-throughput screening. J. Biomol. Screen. 18 (4), 453-461 (2013).
- Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. J. Vis. Exp. (88), (2014).
- Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat. Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).
- Hitti, E., et al. A versatile ribosomal protein promoter-based reporter system for selective assessment of RNA stability and post-transcriptional control. RNA. 16 (6), 1245-1255 (2010).
- Oikonomou, P., Goodarzi, H., Tavazoie, S. Systematic identification of regulatory elements in conserved 3’ UTRs of human transcripts. Cell Rep. 7 (1), 281-292 (2014).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J. Vis. Exp. (87), (2014).
- Conne, B., Stutz, A., Vassalli, J. D. The 3’ untranslated region of messenger RNA: A molecular “hotspot” for pathology. Nat. Med. 6 (6), 637-641 (2000).
- Cheneval, D., Kastelic, T., Fuerst, P., Parker, C. N. A review of methods to monitor the modulation of mRNA stability: a novel approach to drug discovery and therapeutic intervention. J. Biomol. Screen. 15 (6), 609-622 (2010).
- Pascale, A., Govoni, S. The complex world of post-transcriptional mechanisms: is their deregulation a common link for diseases? Focus on ELAV-like RNA-binding proteins. Cell. Mol. Life Sci. 69 (4), 501-517 (2012).
- Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. Impaired pre-mRNA processing and altered architecture of 3’ untranslated regions contribute to the development of human disorders. Int. J. Mol. Sci. 14 (8), 15681-15694 (2013).
- Bhattacharyya, A., Trotta, C. R., Peltz, S. W. Mining the GEMS–a novel platform technology targeting post-transcriptional control mechanisms. Drug Discov. Today. 12 (13-14), 553-560 (2007).
- Peltz, S. W., Welch, E. M., Trotta, C. R., Davis, T., Jacobson, A. Targeting post-transcriptional control for drug discovery. RNA Biol. 6 (3), 329-334 (2009).
