עיצוב, משטח טיפול, סלולרי ציפוי, וCulturing של רשתות עצבי מודולרי מורכב ממעגלי קשרים בין פונקציונלי
Summary
כתב יד זה מתאר פרוטוקול לגדול ברשתות מודולרי מבחנה המורכבת של מעגלים עצביים, מבחינה תפקודית בין מחוברים-מוגבלים במרחב. מסכת פולימרים משמשת לדפוס שכבת חלבון לקדם הידבקות סלולרית על מצע culturing. נוירונים מצופים לגדול באזורים מצופים יצירת קשרים ספונטניים ומציג פעילות אלקטרו.
Abstract
המוח פועל באמצעות ההפעלה מתואמת והתקשורת הדינמית של מכלולים עצביים. שאלה פתוחה גדולה היא איך רפרטואר עצום של מוטיבים הדינמיים, העומדים ביסוד תפקודי מוח המגוונים ביותר, יכול לצאת מארגון טופולוגי ומודולרי קבוע של מעגלים חשמליים במוח. בהשוואה למחקרי in vivo של מעגלים עצביים המציגים קשיים ניסיוניים פנימיים, הכנות במבחנה מציעות אפשרות הרבה יותר גדולה כדי לתפעל ולחקור את התכונות מבניות, דינמיות וכימיות של מערכות עצביות ניסיוניות. עבודה זו מתארת במבחנה מתודולוגיה ניסיונית המאפשר גידול של רשתות מודולרי הולחנו על ידי אסיפות מרחבית שונות, ביניהם מבחינה תפקודית עצביות. הפרוטוקול מאפשר שליטה הארכיטקטורה דו-ממדית (2D) של הרשת העצבית ברמות של מורכבות טופולוגי שונות.
דפוסי רשת רצויים יכולים להיותהושג הן על מכסה מחליק רגיל ומערכי אלקטרודה מיקרו מצע מוטבע. מבני micromachined מוטבעים על פרוסות סיליקון ומשמשים ליצירת שבלונות פולימרים ביולוגית, אשר משלבות את התכונות השליליות של ארכיטקטורת הרשת הרצויה. סטנסילים מונחים על מצעי culturing במהלך הליך ציפוי פני השטח בשכבה מולקולרית לקידום הידבקות סלולרית. לאחר הסרת שבלונות, נוירונים הם מצופים והם יופנו באופן ספונטני לאזורים המצופים. על ידי הפחתת המרחק בין התא, ניתן להשיג מעגלים עצביים או מבודדים או מחוברים. כדי לקדם את הישרדות תא, תאי שיתוף תרבותיים עם רשת עצבית תמיכה הממוקמת בפריפריה של המנה התרבות. קלטות אלקטרו אופטיות של הפעילות של רשתות מודולרי המתקבלות על ידי שימוש בהתאמה מערכי מצע משובץ מיקרו אלקטרודה והדמיה סידן מוצגות. בעוד כל מודול תערוכות spontסינכרונים הגלובליים aneous, ההתרחשות של סנכרון בין-מודול מוסדר על ידי הצפיפות של חיבור בין המעגלים.
Introduction
עדויות ניסויית ותיאורטיות תומכות באפשרות שהמוח פועל באמצעות הפעלה מתואמת של מכלולי תא 1-5, שיכול להיחשב כיחידות פונקציונליות דינמיות שtransiently לתקשר אחד עם השני, עיצוב ומדינות שונות במוח בסיסי. המודולריות פונקציונלית תלויה גם ובקשור לארגון מודולרי המבני של המעגלים חשמליים במוח 6,7. איך תפקוד ומבנה של מעגלים חשמליים במוח באופן הדדי לעצב אחד את השני הוא עדיין אחת השאלות פתוחות העיקריות במדעי המוח. כדי לספק הבנה עמוקה יותר של שאלה זו, חשוב לזהות מסגרות ניסיוניות אופטימליות בו ניתן לטפל ב, לפחות באופן חלקי, בנושאים אלה. מאז נשלט מניפולציה של דינמיקת מרחב ובזמן של רשתות עצביות בניסויי in vivo הוא מאתגר, פיתוח המודלים רשתות עצביות במבחנה הוא עניין משמעותי בשל acc הקלessibility, ניטור, מניפולציה ודוגמנות 8,9. בשנים האחרונות, בטכנולוגיות מבחנה הנתמכות על ידי שיטות דפוסי מצע מתקדמות אפשרו לגרום לרשתות עצביות לפתח מגוון של מבנים מודולריים מוגדרים מראש 3 וללמוד את המאפיינים הפונקציונליים של רשתות עם טופולוגיות הוטלו 10. בפרט, שיטות שמשו לאחרונה לארגן רשתות על ידי הטלת מגבלות פיזיות 4,11. ואכן, כדי ללמוד את הקשר בין המבנה ותפקוד ברשתות עצביות ולספק ייצוג פשוט אך מתקבל על הדעת של אינטראקציה מכלולים עצביים, במבחנה מערכות אמורות לספק תת-אוכלוסיות עצביות בין המחובר. תרבויות הומוגני 2D נחקרו באופן נרחב עצביות לא להטיל מגבלות כלשהן על מרחבי החיווט מתהווה, באמצעות התארגנות העצמית של המעגלים. לכן גישה אפשרית לעצב אסיפות תא מלאכותי ביניהם היא למצב את האוכלוסיות עצביות שונות בירקאזורי ially מובחנים. המרחק בין האזורים אלה אינו מונע את הקשרים בין המכלולים. גישה זו, תוך הבטחת שליטה ניכרת על מורכבות רשת, הוכח לספק רפרטואר עשיר של דגמי סנכרון 6,7,12.
על מנת להקל על culturing שחזור של מכלולים עצביים מודולרי, פרוטוקול להרכיב את הארגון העצמי של רשתות עצביות לאשכולות מקושרים על ידי אקסונים ודנדריטים מוצג ומתואר. מבנה פולימרים לבידוד הפיזי של תרבויות עצביות נוצר מpolydimtheylsiloxane (PDMS). PDMS הוא אלסטומר בשימוש נרחב עבור יישומים ביו-רפואיים בשל biocompatibility, שקיפותה וחדירות לגזים 13. PDMS מוכן ולא נכלל בSU8 micromachined 2,075 14,15 מבנים על ידי PDMS נוזלי על "אדון", כפי שתואר בעבר באל ג'קמן et ציפוי ספין. 16 Tהוא השיג בדוגמת רשתות עצביות מורכבות ממודולים מחוברים בין גודל שונה והם התקבלו בהצלחה בשני coverslips ומערכי מיקרו אלקטרודה (MEAs) 17-20. הצפיפות של קשרים בין המודולים יכולה לשנות את התכונות של סנכרון הרשת, מרשת מסונכרנת באופן מלא, אופיינית לתרבויות אחידות, למדינות חולפות של סנכרון בין המודולים.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול לגדול רשתות עצביות מודולרי 2D במבחנה המורכבת ממעגלים תפקודי-היתר קשור מתואר. ההליך מבוסס על דפוסי שכבת דבק סלולרית. דפוסים מושגת עם שבלונות PDMS לשחזר את התכונה השלילית של ארכיטקטורת הרשת הרצויה. סטנסילים PDMS להגדיר את האזורים שבם שכבת הדבק הסלולרית מופקד?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי האירופית פרויקט BRIANBOW (הסיירים צעירים FP7-, המחברים מבקשים להודות לד"ר יאקופו Tessadori על הערות מועילות על כתב היד, וסילביה Chiappalone על עזרתה בהפקת הגרפיקה המשמשת בוידאו.
Materials
| PDMS, Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| Nalgene Vacuum Chamber | Thermo | 5305-0609 | |
| Poly-D-Lysine PDL | Sigma | P7886 | |
| silicone grease – SILICAID 1010 | aidchim Ltd | H3375 | |
| Spin Coater | Laurell – Technologies Corporation | WS-650-23 | |
| 12 well culture plate | Sigma | CLS3336 | |
| 5-Fluoro-2’-deoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| silicone grease – SILICAID 1010 | aidchim Ltd | H3375 | |
| MEA1060-Inv-BC | Multi Channel Systems | ||
| TC02 | Multi Channel Systems | ||
| Pen Strep | Biological Industries Beit Haemek | 03-033-1c | |
| B-27 | Gibco | 17504044 | |
| glutaMAX | Gibco | 35050-038 | |
| MEM Minimum Essential Medium-Eagle | Biological Industries Beit Haemek | 01-025-1B | |
| Micro Electrode Arrays 4Q | Multi Channel Systems | 60-4QMEA1000iR-Ti-pr | cleaning manual: http://www.multichannelsystems.com |
| silicon wafer | microchem | SU8-2075 | Preparation protocol: www.microchem.com |
Riferimenti
- Buzsaki, G. Neural syntax: cell assemblies, synapsembles, and readers. Neuron. 68, 362-385 (2010).
- Meunier, D., Lambiotte, R., Bullmore, E. T. Modular and hierarchically modular organization of brain networks. Frontiers in Neuroscience. 4, 200 (2010).
- Levy, O., Ziv, N. E., Marom, S. Enhancement of neural representation capacity by modular architecture in networks of cortical neurons. European Journal of Neuroscience. 35, 1753-1760 (2012).
- Berdondini, L., et al. A microelectrode array (MEA) integrated with clustering structures for investigating in vitro neurodynamics in confined interconnected sub-populations of neurons. Sensors and Actuators B-Chemical. 114, 530-541 (2006).
- Bisio, M., Bosca, A., Pasquale, V., Berdondini, L., Chiappalone, M. Emergence of bursting activity in connected neuronal sub-populations. PloS One. 9, e107400 (2014).
- Shein Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. Innate synchronous oscillations in freely-organized small neuronal circuits. PloS One. 5, e14443 (2010).
- Shein-Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. Engineered neuronal circuits: a new platform for studying the role of modular topology. Frontiers in Neuroengineering. 4, 10 (2011).
- Bonifazi, P., et al. In vitro large-scale experimental and theoretical studies for the realization of bi-directional brain-prostheses. Front Neural Circuits. 7, 40 (2013).
- Jungblut, M., Knoll, W., Thielemann, C., Pottek, M. Triangular neuronal networks on microelectrode arrays: an approach to improve the properties of low-density networks for extracellular recording. Biomedical Microdevices. 11, 1269-1278 (2009).
- Marconi, E., et al. Emergent functional properties of neuronal networks with controlled topology. PloS One. 7, e34648 (2012).
- Taylor, A. M., Jeon, N. L. Microfluidic and compartmentalized platforms for neurobiological research. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39, 185-200 (2011).
- Sorkin, R., et al. Compact self-wiring in cultured neural networks. J Neural Eng. 3, 95-101 (2006).
- Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Characterization of polydimethylsiloxane (PDMS) properties for biomedical micro/nanosystems. Biomedical Microdevices. 7, 281-293 (2005).
- Campo, A. G. C. SU-8: a photoresist for high-aspect-ratio and 3D submicron lithography. Journal of Micromechanics and MicroengineeringEmail alert RSS feed. 17, 81-95 (2007).
- Liu, G. T. Y. Kan Y Fabrication of high-aspect-ratio microstructures using SU8 photoresist. Microsystem Technologies. 11, 343-346 (2005).
- Jackman, R. J., Duffy, D. C., Cherniavskaya, O., Whitesides, G. M. Using elastomeric membranes as dry resists and for dry lift-off. Langmuir. 15, 2973-2984 (1999).
- Pine, J. Recording action potentials from cultured neurons with extracellular microcircuit electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 2, 19-31 (1980).
- Gross, G. W., Rieske, E., Kreutzberg, G. W., Meyer, A. New Fixed-Array Multi-Microelectrode System Designed for Long-Term Monitoring of Extracellular Single Unit Neuronal-Activity In vitro. Neuroscience Letters. 6, 101-105 (1977).
- Gross, G. W., Williams, A. N., Lucas, J. H. Recording of spontaneous activity with photoetched microelectrode surfaces from mouse spinal neurons in culture. Journal of Neuroscience Methods. 5, 13-22 (1982).
- Thomas, C. A., Springer, P. A., Loeb, G. E., Berwald-Netter, Y., Okun, L. M. A miniature microelectrode array to monitor the bioelectric activity of cultured cells. Experimental Cell Research. 74, 61-66 (1972).
- Herzog, N., Shein-Idelson, M., Hanein, Y. Optical validation of in vitro extra-cellular neuronal recordings. J Neural Eng. 8, 056008 (2011).
- Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. Journal of Neuroscience Methods. 177, 241-249 (2009).
- Dworak, B. J., Wheeler, B. C. Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture. Lab Chip. 9, 404-410 (2009).
- Georger, J. H., et al. Coplanar Patterns of Self-Assembled Monolayers for Selective Cell-Adhesion and Outgrowth. Thin Solid Films. 210, 716-719 (1992).
- Torimitsu, K., Kawana, A. Selective Growth of Sensory Nerve-Fibers on Metal-Oxide Pattern in Culture. Developmental Brain Research. 51, 128-131 (1990).
- Branch, D. W., Corey, J. M., Weyhenmeyer, J. A., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. Microstamp patterns of biomolecules for high-resolution neuronal networks. Medical & Biological Engineering & Computing. 36, 135-141 (1998).
- Petrelli, A., et al. Nano-volume drop patterning for rapid on-chip neuronal connect-ability assays. Lab on a Chip. 13, 4419-4429 (2013).
- Boehler, M. D., Leondopulos, S. S., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. Hippocampal networks on reliable patterned substrates. Journal of Neuroscience Methods. 203, 344-353 (2012).
