Questo manoscritto descrive un protocollo di crescere in vitro reti modulari composti da spazialmente confinate, circuiti neuronali funzionalmente interconnessi. Una maschera polimerica viene usata per modello uno strato proteico per favorire l'adesione cellulare su substrato di coltura. Neuroni placcato crescono su aree rivestite stabilire connessioni spontanee e che presentano attività elettrofisiologica.
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Articolo metodologico
Design, Trattamento delle superfici, Cellular placcatura, e Coltura di neuronali modulari reti composte di circuiti funzionalmente interconnessi
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il cervello opera attraverso l'attivazione coordinata e la comunicazione dinamica di assiemi neuronali. Un importante questione aperta è come un vasto repertorio di motivi dinamici, che sono alla base funzioni cerebrali più diverse, può emergere da un'organizzazione topologica fissa e modulare di circuiti cerebrali. Rispetto a studi in vivo di circuiti neuronali che presentano difficoltà intrinseche sperimentali, preparati in vitro offrono una possibilità molto più grande di manipolare e sondare le proprietà strutturali, dinamiche e chimiche dei sistemi neuronali sperimentali. Questo lavoro descrive un metodo sperimentale in vitro che permette crescente di reti modulari composti da spazialmente distinte, assemblee di neuroni funzionalmente interconnessi. Il protocollo consente il controllo bidimensionale (2D) architettura della rete neuronale a diversi livelli di complessità topologica.
Un patterning rete desiderata può essererealizzato sia su vetrini regolari e substrato integrato array micro elettrodi. Strutture microlavorati sono impressi su un wafer di silicio e usati per creare matrici polimeriche biocompatibili, che incorporano le caratteristiche negative della architettura di rete desiderato. Le matrici sono disposte sui substrati di coltura durante la procedura di rivestimento con uno strato molecolare per promuovere l'adesione cellulare. Dopo la rimozione delle matrici, i neuroni sono placcati e spontaneamente reindirizzato alle zone rivestite. Diminuendo la distanza inter-vano, è possibile ottenere circuiti neuronali o isolate o interconnessi. Per promuovere la sopravvivenza delle cellule, le cellule sono co-coltura con una rete neuronale supporto che si trova alla periferia del piatto di coltura. Registrazioni elettrofisiologiche e ottiche di attività delle reti modulari ottenuti rispettivamente mediante substrato integrato micro schiere di elettrodi e di imaging di calcio sono presentati. Mentre ogni modulo mostra SPONTsincronizzazioni globali aneous, il verificarsi di sincronizzazione tra moduli è regolata dalla densità di collegamento fra i circuiti.
Introduzione
Evidenze sperimentali e teorici sostengono la possibilità che il cervello opera attraverso l'attivazione coordinata di gruppi di cellule 1-5, che può essere considerato come unità funzionali dinamici che transientemente interagiscono tra loro, sagomatura e sottostanti diversi stati cerebrali. Modularità funzionale dipende anche e associato con l'organizzazione modulare strutturale dei circuiti cerebrali 6,7. Come funzione e la struttura dei circuiti cerebrali reciprocamente forma l'altro è ancora una delle principali questioni aperte nel campo delle neuroscienze. Per fornire una comprensione più approfondita di questa domanda, è impo....
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Protocollo
La procedura è stata effettuata in conformità con le norme NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio ed è stato approvato dall'Università Cura e uso Comitato Tel-Aviv animali (numero di permesso - L-14-019).
1. Preparazione degli strumenti e PDMS
- Preparare il wafer (Table of Materials, o ordinare il wafer da un laboratorio di microfabbricazione), un bisturi, e un paio di pinzette - la sterilizzazione non è necessario.
- Preparare la soluzione di poli-D-lisina (PDL) secondo le seguenti condizioni: 4 mg / ml in 0,1 M tampone borato, pH 8, e conservare a -20 ° C.
- Preparare stencil....
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Risultati
Un SU8-2075 stampo su un wafer di silicio con uno spessore di circa caratteristica 100 micron è stato utilizzato per modellare i PDMS. Il modello era composta di quadrati di varie dimensioni, con una lunghezza laterale e distanza variabile tra 200 e 700 micron (Figura 1B). La dimensione della piazza stata scelta per adattarsi al campo di vista di un 10X (per isole con una lunghezza laterale <800 micron) e un obiettivo 20X (per isole con una lunghezza laterale <400 micron). Tre parametri, vale a di.......
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Discussione
Un protocollo di crescere reti neuronali modulari 2D in vitro composto da circuiti funzionalmente interconnessi è descritto. La procedura si basa su uno strato adesivo patterning cellulare. Patterning si ottiene con PDMS stencil riproduce la caratteristica negativa della architettura di rete desiderato. Stencil PDMS definiscono le aree in cui lo strato adesivo cellulare è depositato. Una volta che le cellule sono placcati, spontaneamente si riuniscono per le isole ricoperte e di auto-organizzarsi in circuiti in.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal BRIANBOW Progetto Europeo (7PQ Giovani Esploratori, Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Jacopo Tessadori per gli utili commenti sul manoscritto, e Silvia Chiappalone per il suo aiuto nel produrre la grafica utilizzata nel video.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| PDMS, Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| Nalgene camera a vuoto | Thermo | 5305-0609 | |
| Poli-D-lisina PDL | Sigma | P7886 | |
| Grasso siliconico - SILICAID 1010 | aidchim Ltd | H3375 | |
| Spin coater | Laurell - Technologies Corporation | WS-650-23 | |
| Piastra di coltura a 12 pozzetti | Sigma | CLS3336 | |
| 5-Fluoro-2'-deossiuridina | Sigma | F0503 | |
| Uridina | Sigma | U3003 | |
| MEA1060-Inv-BC | Sistemi | ||
| TC02 | Sistemi | ||
| Pen Strep | Biological Industries Beit Haemek | 03-033-1C | |
| B-27 | Gibco | 17504044 | |
| glutaMAX | Gibco | 35050-038 | |
| MEM Minimum Essential Medium-Eagle | Biological Industries Beit Haemek | 01-025-1B | |
| Micro Electrode Arrays 4Q | Multi Channel Systems | 60-4QMEA1000iR-Ti-pr | Manuale di pulizia: http:// www.multichannelsystems.com |
| wafer di silicio | SU8-2075 | http://www.microchem.com |
Riferimenti
- Buzsaki, G. Neural syntax: cell assemblies, synapsembles, and readers. Neuron. 68, 362-385 (2010).
- Meunier, D., Lambiotte, R., Bullmore, E. T. Modular and hierarchically modular organization of brain networks. Frontiers in Neuroscience. 4, 200(2010).
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Ristampe e permessi
