رواية القوة الذرية المجهر Biopanning استنادا لعزل مورفولوجيا الكواشف محددة ضد المتغيرات TDP-43 في الضموري العضلي الجانبي التصلب

Summary

Using atomic force microscopy in combination with biopanning technology we created a negative and positive biopanning system to acquire antibodies against disease-specific protein variants present in any biological material, even at low concentrations. We were successful in obtaining antibodies to TDP-43 protein variants involved in Amyotrophic Lateral Sclerosis.

Abstract

بسبب المتغيرات البروتين تلعب أدوارا حاسمة في كثير من الأمراض بما في ذلك TDP-43 في الضموري العضلي الجانبي التصلب (ALS)، ألفا synuclein في باركنسون مرض وبيتا اميلويد وتاو في مرض الزهايمر، من المهم للغاية لتطوير الكواشف التشكل المحددة التي يمكن أن تستهدف بشكل انتقائي هذه البروتينات بأمراض محددة المتغيرات لدراسة دور هذه المتغيرات في علم الأمراض والتطبيقات التشخيصية والعلاجية المحتملة. لقد قمنا بتطوير مجهر القوة الذرية (AFM) تقنيات biopanning رواية تقوم العزلة التي تمكن من الكواشف التي تعترف بشكل انتقائي المتغيرات البروتين بأمراض محددة. هناك مرحلتين الرئيسية المشاركة في هذه العملية، ومراحل بالغسل السلبية والإيجابية. خلال المرحلة بالغسل السلبية، يتم استبعاد فاجات التي هي رد الفعل لمستضدات خارج الهدف من خلال جولات متعددة من بالغسل مطروح باستخدام سلسلة من تم اختيارهم بعناية بعيدا عن الهدف المستضدات. ومن السمات الرئيسية في السلبيةالمرحلة بالغسل هو الاستفادة التصوير AFM لمراقبة العملية والتأكد من أن تتم إزالة جميع الجزيئات فج غير مرغوب فيها. وبالنسبة للمرحلة بالغسل إيجابية، يتم إصلاح المستضد الهدف من الفائدة على سطح الميكا ومزال فاجات ملزمة وفحص لتحديد فاجات التي تربط بشكل انتقائي المستضد الهدف. لا يحتاج البديل البروتين الهدف المراد تنقيتها توفير استخدمت الضوابط بالغسل السلبية المناسبة. حتى استهداف المتغيرات البروتين التي تكون موجودة فقط في تركيزات منخفضة جدا في المواد البيولوجية المعقدة يمكن استخدامها في الخطوة بالغسل إيجابية. من خلال تطبيق هذه التكنولوجيا، وحصلنا على أجسام مضادة لبروتين من المتغيرات TDP-43 التي تم العثور عليها بشكل انتقائي في أنسجة المخ ALS الإنسان. نحن نتوقع أن هذا البروتوكول ينبغي أن تكون قابلة للتطبيق على الكواشف توليد التي تربط بشكل انتقائي المتغيرات البروتين الموجودة في مجموعة واسعة من العمليات والأمراض البيولوجية المختلفة.

Introduction

وجود بدائل البروتين وقد تورط كعامل في تطور العديد من الأمراض بما فيها الأمراض العصبية مثل الزهايمر والشلل الرعاش، ALS والجبهي الصدغي الخرف (FTD) ^{1،2،3،4،5،6،7،8،9 ، 10،11.} ويعتقد أشكال بلازميدة قليلة القسيمات من البروتينات بيتا اميلويد وألفا synuclein أن تكون من الأنواع السامة المسؤولة عن مرض الزهايمر والشلل الرعاش، على التوالي ^2،3،4،5. وقد تم ربط المجاميع من البروتين 43 (TDP-43) TAR DNA ملزم لALS وFTD ^12،13،14. لذلك الكواشف مثل الأجسام المضادة التي يمكن أن تستهدف بشكل انتقائي يمكن للمتغيرات بروتين مختلفة أن تكون أدوات قوية لخدمة علامات تشخيصية وعلاجية محتملة. في هذه الدراسة، وركزنا على تطوير الكواشف التي تربط بشكل انتقائي أنواع من البروتين TDP-43 المتورطين في ALS، ولكن التقنية الواردة في هذه الورقة يجب أن تكون قابلة للتطبيق إلى عزل الكواشف ضد طائفة واسعة من البروتوكول الاضافيعين المتغيرات.

وقد تم تحديد تجميع حشوية من TDP-43 كسمة المرضية في ALS ^{15،16،17،18،19.} وعادة ما يتم العثور TDP-43 في نواة كل الخلايا من فرد العادي، على الرغم من أنه يميل للتنقل بين العصارة الخلوية ونواة ^15،17. تم الكشف عن أشكال ومع ذلك، في ALS تجميعها من TDP-43 في سيتوبلازم الخلايا العصبية والدبقية مختارة مع تركيز أقل وجدت في النواة مما يدل على أن حركة TDP-43 من النواة إلى السيتوبلازم أثناء تطور المرض ^16،20. في حين تم العثور على تجميع TDP-43 في معظم الحالات ALS، فإنه لا حساب لجميع الحالات منذ 1٪ -2٪ من إجمالي الحالات ALS (أو 15٪ -20٪ من الحالات الأسرية ALS) ترتبط طفرات في ديسموتاز الفائق 1 (SOD1) ^15،17 الجين. نظرا للدور الهام للTDP-43 في الغالبية العظمى من الحالات ALS، وهنا علينا أن نركز على تطوير الكواشف الأجسام المضادة مقرها التي يمكن أن تربط بشكل انتقائي لTDP-43 المتغيرات التي هيموجودة في الإنسان ALS أنسجة المخ باستخدام لدينا رواية AFM تقنيات biopanning مقرها.

في البداية نحن بحاجة إلى ذخيرة متنوعة من الأجسام المضادة ملزمة المجالات. نحن الجمع بين ثلاثة نماذج مختلفة من عرض فج سلسلة واحدة نطاق متغير الأضداد شظية (scFvs) مكتبات (توملينسون الأول وJ والمكتبات صفائح ^21). وتنقسم عملية بالغسل إلى مراحل بالغسل السلبية والإيجابية. وتعرض فاجات من المكتبات أولا إلى عملية بالغسل السلبية خلالها فاجات رد الفعل ليتم استبعاد متعددة المستضدات بعيدا عن الهدف. بعد الانتهاء من كل جولة من بالغسل السلبي ضد كل مستضد بعيدا عن الهدف، ويتم رصد هذه العملية عن طريق AFM التصوير لضمان أن كل فج ملزمة المستضدات بعيدا عن الهدف قد أزيلت. إلا بعد التحقق من AFM التصوير التي تتم إزالة كافة فاجات رد الفعل لم نشرع في الهدف التالي. لعزل الكواشف ضد TDP-43 المتغيرات المتورطين في ALS نحن الاستفادة من المستضدات بالغسل السلبية التالية: 1) BSA لإزالة فج التي تربط ضعيفة أو غير خصيصا لبروتينات. 2) مجمعة ألفا synuclein لإزالة الفيروس التي ربط العناصر الهيكلية العامة للبروتينات المجمعة. 3) الخليط أنسجة المخ البشري لإزالة الفيروس التي ربط أي البروتينات أو المكونات الأخرى الموجودة في عينات التشريح من صحة أنسجة المخ البشري؛ 4) immunoprecipitated TDP-43 من الدماغ البشري صحي لإزالة فج التي تربط لجميع TDP-43 الأشكال المرتبطة الدماغ البشري صحي. و5) immunoprecipitated TDP-43 معزولة عن الخليط الدماغ FTD لإزالة فج التي تربط TDP-43 المتغيرات المرتبطة غير ALS-علم الأمراض. بعد إزالة كل فج رد الفعل لجميع المستضدات بعيدا عن الهدف، ثم انتقلنا بعد ذلك إلى المرحلة بالغسل إيجابية خلالها شظايا الأجسام المضادة التي تربط مستضد من الفائدة معزولة، في هذه الحالة TDP-43 immunoprecipitated من أنسجة المخ ALS الإنسان. قد تكون هذه الأجسام المضادة معزولة رد الفعل إلى أشكال تجميعها أو معدلة من TDP-43.

"> التقليدي فج biopanning يركز أساسا على المرحلة بالغسل إيجابية ^22،23. وأضافت مكتبة فج وعادة ما يتم يجمد الهدف من الفائدة ومزال فاجات منضم. وتتضخم وفاجات ثم وإضافتها إلى الهدف مرة أخرى. هذه عملية التضخيم وحضانة وعادة ما تتكرر عدة مرات لزيادة نسبة فج ملزم إيجابي. وفي حين أن الاختلافات من هذه العملية وقد استخدمت على نطاق واسع لعزل الكواشف الأجسام المضادة ضد طائفة واسعة من المستضدات الهدف، فإنها تتطلب عادة كميات كبيرة من النقى الهدف مستضد ^{24،25،26، 27،} في حين أن عمليتنا يتطلب تتبع سوى كميات من المستضد الهدف. بروتوكول الموصوفة هنا يمكن أن تستخدم لعزل الكواشف أن المستضدات الهدف على ربط بشكل انتقائي التي تكون موجودة بتركيزات منخفضة جدا، دون الحاجة لتنقية وبالغسل يمكن القيام بها مباشرة ضد مستضد موجودة في عينات الأنسجة المعقدة. إن استخدام بروتوكولات بالغسل السلبية شاملة كما تم التحقق منهابواسطة AFM يضمن أن الحيوانات المستنسخة معزولة ضد مستضد إيجابي يجب ربط بشكل انتقائي الهدف حتى عندما لا تنقيته أو المخصب.

ونفذت كاستوريرانجان وزملاؤه (2003) من السلبية والإيجابية لعملية biopanning مماثلة لعزل الأجسام المضادة تفاعلية للبلازميدة قليلة القسيمات بيتا اميلويد باستخدام تركيز نانوغرام من الهدف ^5. نحن هنا التوسع في هذه العملية لتمكين جيل من الكواشف التي تربط بشكل انتقائي البروتين بأمراض محددة المتغيرات مباشرة من عينات الأنسجة البشرية. في الدراسات المستقبلية نعتزم مواصلة التحقيق ليس فقط القيمة التشخيصية الكواشف معزولة هنا ولكن أيضا تقييم أهميتها العلاجية لعلاج ALS.

وعموما، يجب أن يكون لدينا رواية AFM التكنولوجيا biopanning مقرها ينطبق على عزل أي مرض معين البروتين البديل في أي مادة بيولوجية دون الحاجة لتنقية البروتين أو التعديل، حتى عندما يكون الهدف مستضد concentratioنانوثانية منخفضة للغاية.

Protocol

1. فج الإنتاج أداء جميع عمليات الإنتاج فج وbiopanning في خزانة السلامة البيولوجية. إنتاج فاجات جزيئات من مكتبات مختلفة (توملينسون المكتبات الأول وJ وصفائح المكتبة 21) لعملية biopanning باستخدام إرشادات الشركة المصنعة (http://w…

Representative Results

في الشكل 1، يوضح التخطيطي عملية بالغسل السلبية التي أزلنا فج ملزم بعيدا عن الهدف مستضدات من مكتبتنا باستخدام immunotubes. بدأنا في البداية مع BSA لأن هذا هو عامل مشترك وحجب أي فج التي سترد nonspecifically مع هذا الهدف سيكون إشكالية في المناعية في المستقبل. المقبل، ونحن إزا?…

Discussion

Protein variants have been shown to be involved in the progression of many neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s, Parkinson’s, ALS and FTD^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11}. Isolation of antibodies that can selectively recognize these different protein variant targets can be effective reagents to study, diagnose and potentially treat such ailments. To generate such variant specific antibodies we have developed a novel biopanning process that utilizes atomic force microscopy to monitor the progress …

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Tomlinson I and J Libraries	MRC (Cambridge, England)
Sheets Library	MRC (Cambridge, England)
2xYT	BD Sciences	244020
Glucose	Amresco	0188-2.5KG
Ampicillin	Amresco	0339-25G	Irritant
KM13 Helper Phage	MRC (Cambridge, England)
Kanamycin	OmniPur	5880	Irritant
Polyethylene Glycol 8000	OmniPur	6510	Irritant
Sodium Chloride	Macron	7647-14-5
Sodium Phosphate Dibasic	Amresco	0404-1KG	Irritant
Potassium Chloride	EMD	PX1405-1	Irritant
Potassium Phosphate Monobasic	Amresco	0781-500G	Irritant
TG1 Cells	MRC (Cambridge, England)
Luria-Bertani Agar	EMD	1.10283.0500
Bovine Serum Albumin	Amresco	0332-100G
STEN buffer	Crystalgen Inc.	33429775
Immunotubes	Thermo Scientific	470319
Mica	Spruce Pine Mica	24365
Tween 20	EMD
Trypsin	Sigma	T-0303	Irritant
Triethylamine	Sigma	T-0886	Flammable
Glycerol	Amresco	0854-1L	Irritant
DNA Plasmid Prep Kit	qiagen	27106	Irritant
Non-Fat Milk Powder	Carnation
96-Well High Binding ELISA Plate	Costar	3590
Anti-M13 HRP	GE Healthcare Life Sciences	27-9421-01
ELISA Femto Chemiluminescence Substrate Kit	Thermo Scientific	37074
Anti-TDP 43 Polyclonal Antibody	ProteinTech	10782-2-AP
A/G Agarose Beads	Santa Cruz Biotechnology	sc-2003
HB 2151 Cells	MRC (Cambridge, England)
Isopropylthiogalactoside	Teknova	13325
9e10 HRP	Santa Cruz Biotechnology	sc-40
Nitrocellulose Membrane	Biorad	162-0115	Flammable
Centrifuge	Thermo Scientific	Sorvall RC 6+
Nanoscope IIIa Atomic Force Microscope	Veeco
AFM Probes	VistaProbes	T300R-10