רומן הכוח האטומי מיקרוסקופית מבוסס Biopanning לבידוד של חומרים כימיים מסוימים מורפולוגיה נגד גרסאות TDP-43 בטרשת לרוחב amyotrophic

Summary

Using atomic force microscopy in combination with biopanning technology we created a negative and positive biopanning system to acquire antibodies against disease-specific protein variants present in any biological material, even at low concentrations. We were successful in obtaining antibodies to TDP-43 protein variants involved in Amyotrophic Lateral Sclerosis.

Abstract

בגלל גרסאות חלבון תפקיד קריטי במחלות רבות, כולל TDP-43 בטרשת לרוחב amyotrophic (ALS), אלפא-סינוקלאין במחלה וביתא-עמילואיד וטאו במחלת אלצהיימר, זה חשוב באופן קריטי לפיתוח חומרים כימיים מסוימים מורפולוגיה שיכולה באופן סלקטיבי יעד פרקינסון חלבון ספציפי למחלה אלה גרסאות כדי ללמוד את התפקיד של גרסאות אלה בפתולוגיה מחלה ועבור יישומים אבחוניים וטיפוליים פוטנציאליים. פיתחנו טכניקות חדשניות במיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) המבוססות biopanning המאפשרות בידוד של חומרים כימיים שסלקטיבי להכיר גרסאות חלבון ספציפית למחלה. ישנם שני שלבים עיקריים מעורבים בתהליך, שלבי צילום פנורמי השליליים וחיוביים. בשלב צילום פנורמי השלילי, פאגים שמגיבים לאנטיגנים מחוץ היעד בוטלו באמצעות סבבים רבים של צילום פנורמי תוסף ניצול סדרה נבחרו בקפידה אנטיגנים מחוץ היעד. תכונה מרכזית בשלילהשלב פנורמי הוא ניצול ההדמיה AFM כדי לפקח על התהליך ולוודא שכל חלקיקי phage לא רצויים יוסרו. בשלב צילום פנורמי החיובי, אנטיגן היעד של ריבית קבועה על משטח נציץ ופאגים מחויבים הם eluted והוקרנו לזהות פאגים שסלקטיבי לקשור את האנטיגן היעד. גרסת חלבון המטרה לא צריכה להיות מטוהרת מספקת בקרות צילום פנורמי השליליות המתאימות כבר בשימוש. אף למקד את גרסאות חלבון שנמצאים רק בריכוזים נמוכים מאוד בחומר ביולוגי מורכב יכול להיות מנוצל בצעד החיובי צילום פנורמי. באמצעות יישום של טכנולוגיה זו, שרכשנו את הנוגדנים לחלבון גרסאות של TDP-43 הנמצאות באופן סלקטיבי ברקמת המוח אנושית ALS. אנו צופים כי פרוטוקול זה צריך להיות ישים ליצירת חומרים כימיים שסלקטיבי לאגד גרסאות חלבון קיימים במגוון רחב של תהליכים ביולוגיים שונים ומחלות.

Introduction

הנוכחות של גרסאות חלבון הייתה מעורבת כגורם בהתפתחות של מחלות רבות, כולל מחלות ניווניות כגון אלצהיימר, פרקינסון, ALS ופרונטוטמפורל דמנציה (FTD) ^{1,2,3,4,5,6,7,8,9 , 10,11.} צורות Oligomeric של בטא-עמילואיד החלבונים ואלפא-סינוקלאין נחשבות למינים הרעילים האחראים לאלצהיימר ופרקינסון, בהתאמה ^2,3,4,5. מצרפים של חלבון (43 TDP-43) TAR DNA מחייבים נקשרו לALS וFTD ^12,13,14. לכן ריאגנטים כמו נוגדנים שיכולים באופן סלקטיבי למקד את גרסאות חלבון השונות יכולות להיות כלי רב עוצמה כדי לשמש כסמנים לאבחון וכתרופות פוטנציאליות. במחקר זה, אנו מתמקדים בפיתוח חומרים כימיים שסלקטיבי לאגד גרסאות של חלבון TDP-43 המעורבים בALS, אך הטכניקה שתוארה במאמר זה צריכה להיות ישימה לבידוד של חומרים כימיים נגד מגוון רחב של protein גרסאות.

צבירת cytoplasmic של TDP-43 זוהתה כתכונה פתולוגית בALS ^{15,16,17,18,19.} בדרך כלל TDP-43 נמצאים בגרעין של כל תאי מאדם נורמלי, למרות שהיא נוטה לעבור בין cytosol והגרעין ^15,17. צורות עם זאת, בALS מצטברים של TDP-43 מזוהות בציטופלסמה של תאי עצב בחר וגליה עם ריכוזים נמוכים יותר נמצאו בגרעין טוען התנועה של TDP-43 מהגרעין אל הציטופלסמה במהלך התקדמות מחלה ^16,20. בעוד צבירה של TDP-43 נמצאת ברוב המכריע של המקרים ALS, זה אינו לוקח בחשבון את כל המקרים מאז 1% -2% מהמקרים כולל ALS (או 15% -20% מהמקרים ALS משפחתיים) צמודים למוטציות ב סופראוקסיד דיסמוטאז 1 ^15,17 גן (SOD1). בגלל התפקיד החשוב של TDP-43 ברוב המכריע של המקרים ALS, כאן אנו מתמקדים בפיתוח חומרים כימיים נוגדנים מבוססים שיכול באופן סלקטיבי להיקשר לTDP-43 וריאנטים שקיים ברקמת המוח אנושית ALS תוך שימוש בטכניקות biopanning מבוסס רומן AFM שלנו.

בתחילה אנו זקוקים לרפרטואר מגוון של תחומים נוגדן מחייב. אנחנו שילבנו שלוש ספריות בר שונה תצוגת הפאג שרשרת אחת תחום משתנה נוגדן (scFvs), (טומלינסון אני וJ וספריות גיליונות ^21). תהליך צילום פנורמי מחולק לשלבי צילום פנורמי שליליים וחיוביים. פאגים מהספריות כפופים ראשון לתהליך צילום פנורמי השלילי שבמהלכו פאגים תגובה לאנטיגנים מחוץ יעד מרובים אינם נכללים. לאחר השלמת כל סיבוב של צילום פנורמי שלילי נגד כל אנטיגן מחוץ היעד, התהליך מנוטר על ידי ההדמיה AFM כדי להבטיח שכל הפאג מחייב אנטיגנים מחוץ היעד הוסר. רק אחרי שאימתי על ידי ההדמיה AFM שכל פאגים התגובה יוסרו אנחנו להמשיך ליעד הבא. כדי לבודד ריאגנטים נגד TDP-43 גרסאות מעורבות בALS אנו מנוצלים אנטיגנים פנורמי השליליים הבאים: 1) BSA כדי להסיר הפאג אשר נקלט חלש או שאינם ספציפי לחלבונים; 2) אלפא-סינוקלאין מצטבר להסיר הפאג אשר נקלט על ידי אלמנטים מבניים הגנרית של חלבונים מצטברים; 3) homogenates רקמת המוח האנושי כדי להסיר הפאג אשר נקלט על ידי כל חלבונים או רכיבים אחרים הנמצאים בדגימות שלאחר המוות של רקמת מוח אדם בריאה; 4) immunoprecipitated TDP-43 ממוח האנושי בריא כדי להסיר הפאג אשר נקלט על ידי כל TDP-43 טפסים הקשורים למוח אנושי בריא; ו -5) immunoprecipitated TDP-43 מבודד מhomogenates מוח FTD להסיר הפאג אשר נקלט TDP-43 וריאנטים הקשורים לפתולוגיה שאינו ALS. לאחר הסרת כל הפאג התגובה לכל אנטיגנים מחוץ היעד, אנחנו לאחר מכן המשכנו את שלב צילום פנורמי החיובי שבמהלכו שברי נוגדנים שקושרים את האנטיגן של עניין מבודדים, במקרה זה TDP-43 immunoprecipitated מרקמת המוח אנושי ALS. נוגדנים מבודדים אלה עשויים להיות תגובתי לצורות מצטברות או שונה של TDP-43.

"> Biopanning הפאג הקונבנציונלי מתמקד בעיקר בשלב צילום פנורמי החיובי ^22,23. בדרך כלל המטרה של עניין היא משותקת, ספריית הפאג הוסיפה ופאגים כבול eluted. אז פאגים הם מוגברים והוסיפו ליעד שוב. תהליך ההגברה והדגירה בדרך כלל חוזרים על עצם מספר פעמים כדי להגדיל את האחוז של הפאג מחייב חיובי. בעוד וריאציות של תהליך זה נעשו שימוש נרחב לבודד את ריאגנטים נוגדנים נגד מגוון רחב של אנטיגנים יעד, הם בדרך כלל דורש כמויות גדולות של אנטיגן היעד המטוהר ^{24,25,26, 27,} ואילו התהליך שלנו דורש רק כמויות זעירות של האנטיגן היעד. הפרוטוקול המתואר כאן יכול לשמש כדי לבודד ריאגנטים שאנטיגנים באופן סלקטיבי לאגד יעד שנמצאים בריכוזים נמוכים מאוד, ללא הצורך בטיהור והצילום פנורמי יכולים להתבצע ישירות נגד הווה אנטיגן בדגימות רקמה מורכבות. השימוש בפרוטוקולי צילום פנורמי שליליים ממצים כפי שאומתעל ידי AFM מבטיח כי שיבוטים המבודדים נגד אנטיגן החיובי צריכים סלקטיבי יחייבו את היעד גם כאשר לא מטוהרים או מועשר.

Kasturirangan ועמיתיו (2003) ביצעו תהליך biopanning שלילי וחיובי דומה לבודד נוגדנים מגיבים לביתא-עמילואיד oligomeric באמצעות ריכוז ננוגרם של היעד ^5. כאן אנו להרחיב על תהליך זה כדי לאפשר את הדור של חומרים כימיים שסלקטיבי לקשור חלבון ספציפי למחלה גרסאות ישירות מדגימות רקמה אנושיות. במחקרים עתידיים בכוונתנו להמשיך לחקור לא רק את הערך האבחנתי של ריאגנטים המבודדים כאן, אלא גם להעריך את הרלוונטיות הטיפוליות שלהם לטיפול ב- ALS.

בסך הכל, הטכנולוגיה הייחודית שלנו לAFM מבוססת biopanning צריכה להיות ישימה לבידודה של כל חלופת חלבון ספציפית למחלה בכל חומר ביולוגי ללא הצורך בטיהור חלבון או שינוי, גם כאשר concentratio אנטיגן היעדns הם נמוכים מאוד.

Protocol

1. הפאג הפקה לבצע את כל תהליכי ייצור הפאג וbiopanning בקבינט בטיחות ביולוגי. לייצר פאגים חלקיקים מהספריות השונות (ספריות אני וJ טומלינסון וגיליונות ספריית 21) לתהליך biopanning באמצעות הוראות היצרן (http://www.lifesciences.sourcebioscience.com…

Representative Results

באיור 1, סכמטי מדגים את תהליך צילום פנורמי השלילי שבו אנו הוסרו הפאג מחייבים אנטיגנים מחוץ יעד מהספרייה שלנו באמצעות immunotubes. אנחנו בתחילה התחלנו עם BSA שכן מדובר בסוכן חסימה נפוץ וכל הפאג שיגיב nonspecifically עם יעד זה יהיה בעייתי בimmunoassays העתיד. בשלב הבא, הסרנו קלסרי?…

Discussion

Protein variants have been shown to be involved in the progression of many neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s, Parkinson’s, ALS and FTD^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11}. Isolation of antibodies that can selectively recognize these different protein variant targets can be effective reagents to study, diagnose and potentially treat such ailments. To generate such variant specific antibodies we have developed a novel biopanning process that utilizes atomic force microscopy to monitor the progress …

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Tomlinson I and J Libraries	MRC (Cambridge, England)
Sheets Library	MRC (Cambridge, England)
2xYT	BD Sciences	244020
Glucose	Amresco	0188-2.5KG
Ampicillin	Amresco	0339-25G	Irritant
KM13 Helper Phage	MRC (Cambridge, England)
Kanamycin	OmniPur	5880	Irritant
Polyethylene Glycol 8000	OmniPur	6510	Irritant
Sodium Chloride	Macron	7647-14-5
Sodium Phosphate Dibasic	Amresco	0404-1KG	Irritant
Potassium Chloride	EMD	PX1405-1	Irritant
Potassium Phosphate Monobasic	Amresco	0781-500G	Irritant
TG1 Cells	MRC (Cambridge, England)
Luria-Bertani Agar	EMD	1.10283.0500
Bovine Serum Albumin	Amresco	0332-100G
STEN buffer	Crystalgen Inc.	33429775
Immunotubes	Thermo Scientific	470319
Mica	Spruce Pine Mica	24365
Tween 20	EMD
Trypsin	Sigma	T-0303	Irritant
Triethylamine	Sigma	T-0886	Flammable
Glycerol	Amresco	0854-1L	Irritant
DNA Plasmid Prep Kit	qiagen	27106	Irritant
Non-Fat Milk Powder	Carnation
96-Well High Binding ELISA Plate	Costar	3590
Anti-M13 HRP	GE Healthcare Life Sciences	27-9421-01
ELISA Femto Chemiluminescence Substrate Kit	Thermo Scientific	37074
Anti-TDP 43 Polyclonal Antibody	ProteinTech	10782-2-AP
A/G Agarose Beads	Santa Cruz Biotechnology	sc-2003
HB 2151 Cells	MRC (Cambridge, England)
Isopropylthiogalactoside	Teknova	13325
9e10 HRP	Santa Cruz Biotechnology	sc-40
Nitrocellulose Membrane	Biorad	162-0115	Flammable
Centrifuge	Thermo Scientific	Sorvall RC 6+
Nanoscope IIIa Atomic Force Microscope	Veeco
AFM Probes	VistaProbes	T300R-10