Novel microscopia a forza atomica Based biopanning per isolamento di Morfologia reagenti specifici contro TDP-43 varianti di Sclerosi Laterale Amiotrofica

Summary

Using atomic force microscopy in combination with biopanning technology we created a negative and positive biopanning system to acquire antibodies against disease-specific protein variants present in any biological material, even at low concentrations. We were successful in obtaining antibodies to TDP-43 protein variants involved in Amyotrophic Lateral Sclerosis.

Abstract

Perché varianti proteiche svolgono un ruolo critico in molte malattie, tra cui TDP-43 in Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA), l'alfa-sinucleina in di malattia e beta-amiloide e tau nella malattia di Alzheimer, è di fondamentale importanza per lo sviluppo morfologia reagenti specifici che possono selettivamente indirizzare Parkinson questi proteina specifica malattia varianti per studiare il ruolo di queste varianti in patologia della malattia e per le potenziali applicazioni diagnostiche e terapeutiche. Abbiamo sviluppato la microscopia a forza atomica (AFM) tecniche biopanning basate nuove che permettono l'isolamento di reagenti che riconoscono selettivamente varianti proteiche malattie specifiche. Ci sono due fasi chiave coinvolti nel processo, le fasi panning negativi e positivi. Durante la fase di panning negativo, fagi che sono reattivi agli antigeni fuori bersaglio vengono eliminate attraverso vari cicli di panning sottrattiva utilizzando una serie di accuratamente selezionati antigeni fuori bersaglio. Una caratteristica fondamentale in senso negativofase panning sta utilizzando l'imaging AFM per monitorare il processo e verificare che tutte le particelle dei fagi indesiderate vengono rimossi. Per la fase di panning positiva, l'antigene bersaglio di interesse è fissato su una superficie di mica e fagi legati sono eluiti e proiettati per identificare fagi che si legano selettivamente l'antigene bersaglio. La variante proteina bersaglio non deve essere purificato fornire sono stati utilizzati gli appropriati controlli negativi panning. Anche bersaglio varianti proteiche che sono presenti solo a concentrazioni molto basse di materiale biologico complesso possono essere utilizzati nella fase di panning positivo. Attraverso l'applicazione di questa tecnologia, abbiamo acquisito anticorpi varianti proteiche di TDP-43 che si trovano selettivamente nel tessuto cerebrale ALS umano. Ci aspettiamo che questo protocollo dovrebbe essere applicabile ai reagenti generazione che si legano selettivamente varianti proteiche presenti in una vasta gamma di diversi processi biologici e malattie.

Introduction

La presenza di varianti proteiche è stato implicato come fattore nella progressione di molte malattie, tra cui le malattie neurodegenerative come l'Alzheimer, il Parkinson, SLA e demenza frontotemporale (FTD) ^{1,2,3,4,5,6,7,8,9 , 10,11.} Forme oligomerici di proteine ​​beta-amiloide e alfa-sinucleina si pensa siano le specie tossiche responsabili della malattia di Alzheimer e di Parkinson, rispettivamente, ^2,3,4,5. Aggregati del TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) sono stati legati alla SLA e FTD ^12,13,14. Reagenti Quindi come gli anticorpi che possono selettivamente colpiscono le diverse varianti proteiche possono essere potenti strumenti per servire come marcatori diagnostici e potenziali terapie. In questo studio, ci siamo concentrati sullo sviluppo di reagenti che si legano selettivamente varianti del TDP-43 proteina implicata nella SLA, tuttavia la tecnica descritta in questo documento dovrebbe essere applicabile all'isolamento di reagenti contro una vasta gamma di protVarianti ein.

Aggregazione citoplasmatica di TDP-43 è stato identificato come una caratteristica patologica nella SLA ^{15,16,17,18,19.} Tipicamente TDP-43 si trova nel nucleo di tutte le cellule di un individuo normale, anche se tende a spostarsi tra citosol e nel nucleo ^15,17. Forme Tuttavia, in ALS aggregati di TDP-43 vengono rilevati nel citoplasma di selezionare neuroni e glia con basse concentrazioni riscontrate nel nucleo suggerire il movimento di TDP-43 dal nucleo al citoplasma durante la progressione della malattia ^16,20. Mentre aggregazione di TDP-43 si trova nella maggior parte dei casi di SLA, che non tiene conto di tutti i casi dal 1% -2% del totale casi di SLA (o 15% -20% dei casi di SLA familiare) sono collegate a mutazioni nel superossido dismutasi 1 (SOD1) gene ^15,17. A causa del ruolo importante di TDP-43 nella maggior parte dei casi di SLA, qui ci concentriamo sullo sviluppo di anticorpi reattivi based che può selettivamente legarsi al TDP di 43 varianti che sonopresente in tessuto cerebrale SLA umano utilizzando le nostre tecniche biopanning basato romanzo AFM.

Inizialmente abbiamo bisogno di un vasto repertorio di domini di legame anticorpo. Abbiamo unito tre singola catena di frammenti di anticorpi dominio variabile phage display diverso librerie (scFvs), (Tomlinson I e J e biblioteche Sheets ^21). Il processo di panning è diviso in fasi panning negativi e positivi. Fagi dalle librerie vengono prima sottoposti al processo di panning negativo durante il quale fagi reattivo sono esclusi antigeni multipli fuori bersaglio. Dopo il completamento di ogni turno di panning negativo contro l'antigene di fuori bersaglio, il processo è monitorato da immagini AFM per assicurare che tutte vincolanti gli antigeni fuori bersaglio fago sono stati rimossi. Solo dopo aver verificato da AFM immagini che tutti i fagi reattivi vengono rimossi dobbiamo procedere al prossimo obiettivo. Per isolare i reagenti contro TDP-43 varianti implicati nella SLA abbiamo utilizzato i seguenti antigeni panning negativi: 1) BSA per rimuovere fago che legano debolmente o non specificamente alle proteine; 2) aggregati di alfa-sinucleina per rimuovere fago che si legano a elementi strutturali generici di proteine ​​aggregate; 3) omogenati di tessuto cerebrale umano per rimuovere fago che legarsi agli proteine ​​o altri componenti presenti nei campioni post-mortem del tessuto cerebrale umano sano; 4) immunoprecipitato TDP-43 dal cervello umano sano di rimuovere fago che si legano a tutti TDP-43 forme associate con il cervello umano sano; e 5) immunoprecipitata TDP-43 isolato da FTD omogenati di cervello per rimuovere fago che legano TDP 43-varianti associate con i non-ALS patologia. Dopo la rimozione di tutto fago reattiva a tutti gli antigeni bersaglio off, si è quindi proceduto alla fase panning positiva durante la quale i frammenti di anticorpi che legano l'antigene di interesse sono isolati, in questo caso TDP-43 immunoprecipitato da tessuto cerebrale umano ALS. Questi anticorpi isolati possono essere reattivi a forme aggregate o modificate di TDP-43.

"> Convenzionale fago biopanning concentra principalmente sulla fase panning positiva ^22,23. Solitamente il bersaglio di interesse è immobilizzato, la libreria fagica aggiunto e fagi legati eluito. I fagi sono poi amplificati e aggiunto al bersaglio di nuovo. Questo processo di amplificazione e l'incubazione di solito è ripetuta più volte per aumentare la percentuale di fago legame positivo. Mentre variazioni di questo processo sono stati ampiamente utilizzati per isolare anticorpi reattivi contro un'ampia gamma di antigeni bersaglio, generalmente richiede grandi quantità di antigene purificato bersaglio ^{24,25,26, 27,} mentre il nostro processo richiede in tracce l'antigene bersaglio. Il protocollo qui descritto può essere usato per isolare reagenti antigeni bersaglio selettivamente bind che sono presenti a concentrazioni molto basse, senza la necessità di purificazione e il panning possono essere eseguite direttamente contro antigene presente in campioni di tessuto complesse. L'uso di protocolli di panning negativi esaustivi, verificatada AFM assicura che i cloni isolati contro l'antigene positivo dovrebbe legare selettivamente l'obiettivo anche quando non purificato o arricchito.

Kasturirangan e colleghi (2003) hanno effettuato un simile processo biopanning negativo e positivo di isolare anticorpi reattivi di oligomeri di beta-amiloide con concentrazione nanogrammo dell'obiettivo ^5. Qui abbiamo espandere su questo processo per consentire la generazione di reagenti che legano selettivamente proteina specifica malattia varianti direttamente da campioni di tessuto umano. In studi futuri intendiamo approfondire non solo il valore diagnostico dei reagenti isolato qui, ma anche valutare la loro rilevanza terapeutica per il trattamento della SLA.

Nel complesso, la nostra nuova tecnologia AFM biopanning base dovrebbe essere applicabile all'isolamento di qualsiasi malattia-specifica variante di proteine ​​in qualsiasi materiale biologico senza la necessità di purificazione delle proteine ​​o modifica, anche quando il bersaglio antigene concentrations sono estremamente basse.

Protocol

1. Phage Produzione Eseguire tutti i processi produttivi fago e biopanning in un armadio biosicurezza. Produrre fagi particelle delle diverse librerie (librerie Tomlinson I e J e fogli di biblioteca 21) per il processo biopanning utilizzando le istruzioni del produttore (http://www.lifesciences.sourcebioscience.com/media/143421/tomlinsonij.pdf). NOTA BENE: Usiamo più librerie nel nostro processo di panning per aumentare la diversità degli anticorpi disponibili. Brevemente, batter…

Representative Results

Nella figura 1, lo schema illustrato il processo di panning negativo con cui abbiamo rimosso fago vincolante antigeni fuori bersaglio della nostra biblioteca con immunotubes. Inizialmente abbiamo iniziato con BSA in quanto si tratta di un agente bloccante comune e qualsiasi fago che reagiscono in maniera non specifica con questo obiettivo sarebbe problematico in saggi immunologici futuri. Quindi, abbiamo rimosso leganti a aggregata alfasinucleina per eliminare fago che sono reattivi con strutture generi…

Discussion

Protein variants have been shown to be involved in the progression of many neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s, Parkinson’s, ALS and FTD^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11}. Isolation of antibodies that can selectively recognize these different protein variant targets can be effective reagents to study, diagnose and potentially treat such ailments. To generate such variant specific antibodies we have developed a novel biopanning process that utilizes atomic force microscopy to monitor the progress …

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Tomlinson I and J Libraries	MRC (Cambridge, England)
Sheets Library	MRC (Cambridge, England)
2xYT	BD Sciences	244020
Glucose	Amresco	0188-2.5KG
Ampicillin	Amresco	0339-25G	Irritant
KM13 Helper Phage	MRC (Cambridge, England)
Kanamycin	OmniPur	5880	Irritant
Polyethylene Glycol 8000	OmniPur	6510	Irritant
Sodium Chloride	Macron	7647-14-5
Sodium Phosphate Dibasic	Amresco	0404-1KG	Irritant
Potassium Chloride	EMD	PX1405-1	Irritant
Potassium Phosphate Monobasic	Amresco	0781-500G	Irritant
TG1 Cells	MRC (Cambridge, England)
Luria-Bertani Agar	EMD	1.10283.0500
Bovine Serum Albumin	Amresco	0332-100G
STEN buffer	Crystalgen Inc.	33429775
Immunotubes	Thermo Scientific	470319
Mica	Spruce Pine Mica	24365
Tween 20	EMD
Trypsin	Sigma	T-0303	Irritant
Triethylamine	Sigma	T-0886	Flammable
Glycerol	Amresco	0854-1L	Irritant
DNA Plasmid Prep Kit	qiagen	27106	Irritant
Non-Fat Milk Powder	Carnation
96-Well High Binding ELISA Plate	Costar	3590
Anti-M13 HRP	GE Healthcare Life Sciences	27-9421-01
ELISA Femto Chemiluminescence Substrate Kit	Thermo Scientific	37074
Anti-TDP 43 Polyclonal Antibody	ProteinTech	10782-2-AP
A/G Agarose Beads	Santa Cruz Biotechnology	sc-2003
HB 2151 Cells	MRC (Cambridge, England)
Isopropylthiogalactoside	Teknova	13325
9e10 HRP	Santa Cruz Biotechnology	sc-40
Nitrocellulose Membrane	Biorad	162-0115	Flammable
Centrifuge	Thermo Scientific	Sorvall RC 6+
Nanoscope IIIa Atomic Force Microscope	Veeco
AFM Probes	VistaProbes	T300R-10