Novel microscopia a forza atomica Based biopanning per isolamento di Morfologia reagenti specifici contro TDP-43 varianti di Sclerosi Laterale Amiotrofica

Stephanie M. Williams; Lalitha Venkataraman; Huilai Tian; Galam Khan; Brent T. Harris; Michael R. Sierks

doi:10.3791/52584

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Articolo metodologico

Novel microscopia a forza atomica Based biopanning per isolamento di Morfologia reagenti specifici contro TDP-43 varianti di Sclerosi Laterale Amiotrofica

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DOI:

10.3791/52584

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12 febbraio 2015

Stephanie M. Williams¹ , Lalitha Venkataraman¹ , Huilai Tian¹ , Galam Khan² , Brent T. Harris²^,³ , Michael R. Sierks¹

¹School for Engineering of Matter, Transport and Energy, Arizona State University, ²Department of Neurology, Georgetown University Medical Center, ³Department of Pathology, Georgetown University Medical Center

In questo articolo

Sommario

Utilizzando la microscopia a forza atomica in combinazione con la tecnologia di biopanning abbiamo creato un sistema di biopanning negativo e positivo per acquisire anticorpi contro varianti proteiche specifiche per la malattia presenti in qualsiasi materiale biologico, anche a basse concentrazioni. Siamo riusciti a ottenere anticorpi contro le varianti della proteina TDP-43 coinvolte nella sclerosi laterale amiotrofica.

Abstract

Perché varianti proteiche svolgono un ruolo critico in molte malattie, tra cui TDP-43 in Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA), l'alfa-sinucleina in di malattia e beta-amiloide e tau nella malattia di Alzheimer, è di fondamentale importanza per lo sviluppo morfologia reagenti specifici che possono selettivamente indirizzare Parkinson questi proteina specifica malattia varianti per studiare il ruolo di queste varianti in patologia della malattia e per le potenziali applicazioni diagnostiche e terapeutiche. Abbiamo sviluppato la microscopia a forza atomica (AFM) tecniche biopanning basate nuove che permettono l'isolamento di reagenti che riconoscono selettivamente varianti proteiche malattie specifiche. Ci sono due fasi chiave coinvolti nel processo, le fasi panning negativi e positivi. Durante la fase di panning negativo, fagi che sono reattivi agli antigeni fuori bersaglio vengono eliminate attraverso vari cicli di panning sottrattiva utilizzando una serie di accuratamente selezionati antigeni fuori bersaglio. Una caratteristica fondamentale in senso negativofase panning sta utilizzando l'imaging AFM per monitorare il processo e verificare che tutte le particelle dei fagi indesiderate vengono rimossi. Per la fase di panning positiva, l'antigene bersaglio di interesse è fissato su una superficie di mica e fagi legati sono eluiti e proiettati per identificare fagi che si legano selettivamente l'antigene bersaglio. La variante proteina bersaglio non deve essere purificato fornire sono stati utilizzati gli appropriati controlli negativi panning. Anche bersaglio varianti proteiche che sono presenti solo a concentrazioni molto basse di materiale biologico complesso possono essere utilizzati nella fase di panning positivo. Attraverso l'applicazione di questa tecnologia, abbiamo acquisito anticorpi varianti proteiche di TDP-43 che si trovano selettivamente nel tessuto cerebrale ALS umano. Ci aspettiamo che questo protocollo dovrebbe essere applicabile ai reagenti generazione che si legano selettivamente varianti proteiche presenti in una vasta gamma di diversi processi biologici e malattie.

Introduzione

La presenza di varianti proteiche è stato implicato come fattore nella progressione di molte malattie, tra cui le malattie neurodegenerative come l'Alzheimer, il Parkinson, SLA e demenza frontotemporale (FTD) ^{1,2,3,4,5,6,7,8,9 , 10,11.} Forme oligomerici di proteine beta-amiloide e alfa-sinucleina si pensa siano le specie tossiche responsabili della malattia di Alzheimer e di Parkinson, rispettivamente, ^2,3,4,5. Aggregati del TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) sono stati legati alla SLA e FTD ^12,13,14. Reagenti Quindi come gli anticorpi che possono selettivamente colpiscono le diverse varianti proteiche possono essere potenti st....