Novel Microscopia de Força Atômica bioprospecção Based para Isolamento de Morfologia reagentes específicos contra TDP-43 variantes em Esclerose Lateral Amiotrófica

Summary

Using atomic force microscopy in combination with biopanning technology we created a negative and positive biopanning system to acquire antibodies against disease-specific protein variants present in any biological material, even at low concentrations. We were successful in obtaining antibodies to TDP-43 protein variants involved in Amyotrophic Lateral Sclerosis.

Abstract

Porque variantes de proteína desempenham papéis críticos em muitas doenças, incluindo TDP-43 em Esclerose Lateral Amiotrófica (ALS), alfa-sinucleína em doença e beta-amilóide e de tau na doença de Alzheimer, é criticamente importante desenvolver reagentes morfologia específicos que podem direccionar selectivamente Parkinson estes proteína específica da doença variantes para estudar o papel destas variantes na patologia da doença e para potenciais aplicações de diagnóstico e terapêuticas. Nós desenvolvemos novos microscopia de força atômica (AFM) técnicas de bioprospecção base que permitem o isolamento de reagentes que reconhecem seletivamente variantes de proteína de doenças específicas. Existem duas fases principais envolvidos no processo, as fases de panning negativos e positivos. Durante a fase de panning negativo, os fagos que são reativos a antígenos off-alvo são eliminados através de várias rodadas de panning subtrativo utilizando uma série de cuidadosamente selecionados antígenos fora do alvo. Uma característica fundamental no negativofase panning está utilizando imagens AFM para acompanhar o processo e confirmar que todas as partículas de fago indesejados são removidos. Para a fase de deslizamento positivo, o antigénio alvo de interesse é fixa sobre uma superfície de mica e fagos ligados são eluídos e pesquisados ​​para identificar os fagos que se ligam selectivamente o antigénio alvo. A variante da proteína alvo não necessita de ser purificada para proporcionar os controlos negativos adequados panning foram utilizados. Mesmo variantes da proteína alvo que estão presentes apenas em concentrações muito baixas em material biológico complexo pode ser utilizado no passo de filtração positivo. Através da aplicação desta tecnologia, adquirimos anticorpos para proteínas variantes de TDP-43 que são encontrados seletivamente no tecido cerebral humano ALS. Espera-se que este protocolo deve ser aplicável para geração de reagentes que se ligam selectivamente variantes proteicas presentes numa grande variedade de diferentes processos biológicos e doenças.

Introduction

A presença de variantes de proteína tem sido implicada como um factor na progressão de muitas doenças, incluindo as doenças neurodegenerativas, tais como Alzheimer, Parkinson, ALS e demência fronto-temporal (FTD) ^{1,2,3,4,5,6,7,8,9 , 10,11.} Formas oligoméricas de proteínas da beta-amilóide e alfa-sinucleína está pensado para ser as espécies tóxicas responsáveis ​​pela doença de Alzheimer e de Parkinson, respectivamente ^2,3,4,5. Agregados de TAR ADN da proteína de ligação 43 (TDP-43) têm sido associados a ALS e FTD ^12,13,14. Portanto reagentes tais como anticorpos que podem atingir selectivamente as diferentes variantes de proteína podem ser ferramentas poderosas para servir como marcadores de diagnóstico e terapêuticas potenciais. Neste estudo, focado no desenvolvimento de reagentes que se ligam selectivamente variantes da proteína TDP-43 implicado em ELA, no entanto a técnica descrita no presente documento deve ser aplicável ao isolamento de reagentes contra uma ampla gama de protein variantes.

Agregação citoplasmática de TDP-43 foi identificado como uma característica patológica em ALS ^{15,16,17,18,19.} Tipicamente TDP-43 encontra-se no núcleo de todas as células de um indivíduo normal, apesar de tender a mover-se entre o citoplasma e núcleo ^15,17. Formas No entanto, em ALS agregados de TDP-43 são detectadas no citoplasma de neurónios e células da glia seleccione com concentrações mais baixos encontrados no núcleo, sugerindo o movimento de TDP-43 a partir do núcleo para o citoplasma durante a progressão da doença ^16,20. Apesar da agregação de TDP-43 encontra-se na maioria dos casos de ALS, não leva em conta todos os casos, desde 1% a 2% do total de casos de ALS (ou 15% -20% dos casos de ALS familiar) estão ligados a mutações no superóxido dismutase 1 (SOD1) ^15,17 gene. Devido ao importante papel da TDP-43, na grande maioria dos casos de ELA, aqui vamos focar no desenvolvimento de reagentes de anticorpos com base que pode se ligar seletivamente a TDP-43 variantes que sãopresentes no tecido cerebral humano ALS utilizando nossas técnicas de bioprospecção baseado romance AFM.

Inicialmente precisamos de um repertório diversificado de ligação do anticorpo domínios. Combinamos três (scFvs) bibliotecas diferente de apresentação de fagos de fragmentos de anticorpos de domínio variável de cadeia única, (Tomlinson I e J e folhas de bibliotecas ^21). O processo de filtração é dividida em fases panning negativos e positivos. Os fagos das bibliotecas são primeiro submetido ao processo de panning negativo durante o qual os fagos reactivo para fora múltiplos antigénios-alvo são excluídos. Após a conclusão de cada ciclo de prospecção negativa contra cada antigénio fora do alvo, o processo é acompanhado por AFM imagiologia para assegurar que todos os fagos de ligação dos antigénios-alvo fora ter sido removido. Somente após a verificação pela AFM imagem que todos os fagos reativas são removidos podemos avançar para o próximo alvo. Para isolar reagentes contra TDP-43 variantes implicados em ALS utilizamos os seguintes antígenos panning negativos: 1) de BSA para remover fago que se ligam fracamente ou não-especificamente a proteínas; 2) alfa-sinucleína agregado para remover fagos que se ligam a elementos estruturais genéricas de proteínas agregadas; 3) homogenatos de tecido cerebral humano para remover fagos que se ligam a quaisquer proteínas ou outros componentes presentes em amostras pós-mortem de tecido de cérebro humano saudável; 4) imunoprecipitou TDP-43 do cérebro humano saudável para remover fago que se ligam a todos os TDP-43 formas associadas com o cérebro humano saudável; e 5) imunoprecipitada a TDP-43 isolada a partir de homogenatos de cérebro de FTD para remover fago que se ligam TDP-43 variantes associadas com a patologia não-ALS. Após remoção de todo o fago reactivo a todos os antigénios off-alvo, que, em seguida, procedeu-se à fase de filtração positivo durante o qual os fragmentos de anticorpos que se ligam ao antigénio de interesse são isolados, neste caso TDP-43 imunoprecipitada a partir de tecido cerebral humano ALS. Estes anticorpos isolados podem ser reativas a formas de TDP-43 agregados ou modificados.

"> Convencional bioprospecção fago centra-se principalmente na fase de filtração positiva ^22,23. Normalmente, o alvo de interesse estiver imobilizado, a biblioteca de fago adicionado e fagos ligados eluídos. Os fagos são então amplificados e adicionado ao alvo novamente. Este processo de amplificação e a incubação geralmente é repetido várias vezes para aumentar a percentagem de fago de ligação positivo. Embora variações deste processo têm sido extensivamente usados ​​para isolar os reagentes de anticorpos contra uma vasta gama de antigénios alvo, que geralmente requer grandes quantidades de antigénio alvo purificada ^{24,25,26, 27,} enquanto que o nosso processo requer apenas pequenas quantidades do antigénio alvo. O protocolo aqui descrito pode ser utilizado para isolar os reagentes que se ligam selectivamente a antigénios alvo que estão presentes em concentrações muito baixas, sem a necessidade de purificação e a filtração pode ser efectuada directamente contra antígeno presente em amostras de tecidos complexos. O uso de protocolos panning negativas exaustivas como verificadopor AFM garante que clones isolados contra o antígeno positivo deve se ligar seletivamente o alvo, mesmo quando não purificado ou enriquecido.

Kasturirangan e colegas (2003) levaram a cabo um processo de bioprospecção negativo e positivo semelhante para isolar anticorpos reativos ao oligom�ica beta-amilóide utilizando concentração nanograma do alvo ^5. Aqui vamos expandir esse processo para permitir a geração de reagentes que se ligam seletivamente a proteína específica da doença variantes diretamente de amostras de tecidos humanos. Em estudos futuros, pretendemos investigar não só o valor diagnóstico dos reagentes isolados aqui, mas também avaliar a sua relevância terapêutica para o tratamento de ELA.

No geral, a nova tecnologia AFM bioprospecção com base deve ser aplicável ao isolamento de qualquer variante da proteína específica da doença em qualquer material biológico sem a necessidade de purificação da proteína ou modificação, mesmo quando o antigénio alvo Concentraçãns são extremamente baixos.

Protocol

1. Produção Phage Execute todos os processos de produção de fagos e bioprospecção em uma cabine de segurança biológica. Produzir partículas de fagos das diferentes bibliotecas (bibliotecas Tomlinson I e J e folhas de bibliotecas 21) para o processo de bioprospecção usando as instruções do fabricante (http://www.lifesciences.sourcebioscience.com/media/143421/tomlinsonij.pdf). NOTA: Nós usamos várias bibliotecas em nosso processo de panning para aumentar a diversidade dos antico…

Representative Results

Na Figura 1, o esquema demonstra o processo de deslizamento negativo pelo qual removido fago de ligação antigénios fora do alvo da nossa biblioteca utilizando imunotubos. Inicialmente começou com BSA uma vez que este é um agente bloqueador comum e qualquer fago que iria reagir de forma não específica com esta meta seria problemático em imunoensaios futuras. Em seguida, removeu-ligantes para agregados alfa-sinucleína para eliminar fagos que são reactivos com estruturas genéricas de proteínas …

Discussion

Protein variants have been shown to be involved in the progression of many neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s, Parkinson’s, ALS and FTD^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11}. Isolation of antibodies that can selectively recognize these different protein variant targets can be effective reagents to study, diagnose and potentially treat such ailments. To generate such variant specific antibodies we have developed a novel biopanning process that utilizes atomic force microscopy to monitor the progress …

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Tomlinson I and J Libraries	MRC (Cambridge, England)
Sheets Library	MRC (Cambridge, England)
2xYT	BD Sciences	244020
Glucose	Amresco	0188-2.5KG
Ampicillin	Amresco	0339-25G	Irritant
KM13 Helper Phage	MRC (Cambridge, England)
Kanamycin	OmniPur	5880	Irritant
Polyethylene Glycol 8000	OmniPur	6510	Irritant
Sodium Chloride	Macron	7647-14-5
Sodium Phosphate Dibasic	Amresco	0404-1KG	Irritant
Potassium Chloride	EMD	PX1405-1	Irritant
Potassium Phosphate Monobasic	Amresco	0781-500G	Irritant
TG1 Cells	MRC (Cambridge, England)
Luria-Bertani Agar	EMD	1.10283.0500
Bovine Serum Albumin	Amresco	0332-100G
STEN buffer	Crystalgen Inc.	33429775
Immunotubes	Thermo Scientific	470319
Mica	Spruce Pine Mica	24365
Tween 20	EMD
Trypsin	Sigma	T-0303	Irritant
Triethylamine	Sigma	T-0886	Flammable
Glycerol	Amresco	0854-1L	Irritant
DNA Plasmid Prep Kit	qiagen	27106	Irritant
Non-Fat Milk Powder	Carnation
96-Well High Binding ELISA Plate	Costar	3590
Anti-M13 HRP	GE Healthcare Life Sciences	27-9421-01
ELISA Femto Chemiluminescence Substrate Kit	Thermo Scientific	37074
Anti-TDP 43 Polyclonal Antibody	ProteinTech	10782-2-AP
A/G Agarose Beads	Santa Cruz Biotechnology	sc-2003
HB 2151 Cells	MRC (Cambridge, England)
Isopropylthiogalactoside	Teknova	13325
9e10 HRP	Santa Cruz Biotechnology	sc-40
Nitrocellulose Membrane	Biorad	162-0115	Flammable
Centrifuge	Thermo Scientific	Sorvall RC 6+
Nanoscope IIIa Atomic Force Microscope	Veeco
AFM Probes	VistaProbes	T300R-10