Here, we present a protocol for cell transplantation of zebrafish skeletal muscle and embryonal rhabdomyosarcoma (ERMS) into adult immune compromised rag2E450fs homozygous mutant zebrafish. This protocol allows for the efficient analysis of regeneration and malignant transformation of muscle cells.
Sebrafisk har blitt et kraftig verktøy for å vurdere utvikling, gjenfødelse, og kreft. Mer nylig har allograft celle transplantasjon protokoller blitt utviklet som tillatelse engraftment av normale og maligne celler i bestrålt, syngent, og immun kompromittert voksen sebrafisk. Disse modellene når kombinert med optimaliserte celle transplantasjon protokoller tillate for rask vurdering av stamcellefunksjonen, regenerering etter skade, og kreft. Her presenterer vi en metode for celle transplantasjon av sebrafisk voksen skjelettmuskulatur og embryonal rhabdomyosarcoma (ERMS), en pediatrisk sarkom som deler egenskaper med embryonale muskler, inn immun kompromittert voksen rag2 E450fs homozygot mutant sebrafisk. Viktigere er disse dyr mangler T-celler og har redusert B-celle-funksjon, tilrettelegging for innpoding av et bredt spekter av vev fra ubeslektede donordyrene. Våre optimaliserte protokoller viser at fluoresceinmerket muskelcelle preparasjon fra α-aktin-RFP transgen sebrafisk innpode robust når implantert i ryggmuskulaturen av rag2 homozygot mutant fisk. Vi viser også engraftment av fluorescerende-transgen ERMS hvor fluorescens er begrenset til celler basert på differensiering status. Spesifikt ble ERMS opprettet i AB-stamme myf5-GFP; mylpfa-mCherry doble transgene dyr og tumorer injisert i peritoneum til voksen immun kompromittert fisk. Anvendeligheten av disse protokollene strekker seg til innpoding av et bredt spekter av normale og maligne donorceller som kan bli implantert inn i ryggmuskulaturen eller i peritoneum fra voksne sebrafisk.
Sebrafisk er en utmerket modell for regenerative studier fordi de kan regenerere amputert finnene, samt en skadet hjerne, retina, ryggmarg, hjerte, skjelettmuskel og andre vev 1. Stamcelle og regenerative studier i voksen sebrafisk har i stor grad fokusert på karakterisering av regenerering i respons til skade, mens identifisering av stamceller og stamceller fra ulike vev av celletransplantasjon har bare nylig blitt utforsket to. Sebrafisk har også blitt anvendt for undersøkelse av kreft gjennom generering av transgene cancermodeller som etterligner human sykdom 3-10.
I innstillingen av kreft, har celletransplantasjon tilnærminger blitt allment vedtatt og tillate dynamisk vurdering av viktige kreft prosesser, inkludert selvfornyelse 11, funksjonell heterogenitet 12,13, neovascularization 14, spredning,terapi responser 15, og invasjon 16,17. Imidlertid er innpodet celler ofte avvist fra mottaker fisk på grunn av å være vert for immunforsvaret som angriper og dreper pode 18. Flere metoder er blitt brukt for å overvinne avvisning av transplantert celler. For eksempel, kan mottaker dyr immunsystem bli forbigående ablated av lavdose gamma-bestråling før transplantasjonen 18,19. Imidlertid vil mottakeren immunsystemet gjenopprette etter 20 dager etter bestråling og drepe donorceller 18. Alternativt har deksametason behandling blitt anvendt for å undertrykke T og B-cellefunksjonen, noe som gir lengre immunundertrykkende kondisjonering og tilrettelegging for innpoding av et bredt spekter av humane tumorer i opptil 30 dager 14. Disse eksperimentene krever konstant medikamentdosering og er begrenset til å studere fra solide tumorer. Langsiktige engraftment analyser har brukt genetisk identiske syngene linjene 20-22, hvor donor og recipient celler er immune matchet. Men disse modellene krever transgene linjer av interesse å bli krysset inn i syngent bakgrunnen for mer enn fire generasjoner til å produsere fullt syngene linjer. For å unngå problemer med immunavstøtning i mottaker fisk, har gruppen vår nylig utviklet en immun kompromittert rag2 E450fs homozygote mutante (ZFIN allel betegnelse rag2 FB101) linje som har redusert T- og B-celle-funksjon, og som tillater innpoding av et bredt spekter av vev 23. Lignende svekket immunforsvar musemodeller har vært brukt mye for celle transplantasjon av mus og menneskelig vev 24.
Her presenterer vi metoder for transplantasjon av skjelettmuskulatur og embryonal rhabdomyosarcoma (ERMS), en pediatrisk sarkom som deler egenskaper med muskel-skjelettlidelser, i den nylig beskrevet rag2 homozygot mutant sebrafisk. Tilgjengeligheten av en immun kompromittert voksen sebrafiskutvider vår evne til å utføre store celle transplantasjon studier for å direkte visualisere og vurdere stamcelleselvfornyelse innenfor normale og maligne vev. Med denne metoden, fluoresceinmerket muskelcellepreparater fra voksen α-aktin-RFP 25 transgen sebrafisk robust innpode i rag2 homozygot mutant sebrafisk etter injeksjon i ryggmuskulaturen. Videre viser vi engraftment og utvidelse av primær myf5 -GFP; mylpfa- mCherry transgene ERMS følgende intraperitoneal injeksjon i rag2 E450fs homozygot mutant sebrafisk. Nytten av disse protokollene går utover de viste eksempler og enkelt kan brukes til flere sebrafisk regenerative vev og kreft.
Effektiv og robust innpoding av voksen dorsal skjelettmuskel ble oppnådd med en meget enkel celle fremstillingsmetode etterfulgt av injeksjon av celler i den dorsale muskulaturen rag2 homozygote mutante fisk. Generelt, intramuskulære injeksjonsprosedyrer var meget robust, med noen assosiert død umiddelbart etter implantering prosedyre, som strekker seg fra 10% til 35%, avhengig av forsøket. Ytterligere optimalisering vil trolig dreie seg om utnyttelse av mindre måle nåler for injeksjon og utvikling av stasjonær injeksjonsapparat ved hjelp av et mikroskop og micromanipulator, noe som vil legge til rette for enkel implantere celler. Vår tilnærming også brukt usorterte muskelceller fra donordyr og inneholdt bare ca. 30% muskel stamceller. Bruk av transgene reporter linjer som etikett stamceller og FACS isolasjon vil trolig gi beriket cellesuspensjoner som fører til økt engraftment til mottaker fisk. Skjelettmuskulatur calen kan også anrikes og dyrket før transplantasjon, som tidligere beskrevet 29. Bemerkelsesverdig, våre resultater tyder også på at trinnene nisje etablering og differensiering av donor muskelvev skje før 10 dager etter transplantasjonen, etablere denne modellen som en robust og rask eksperimentell plattform for å vurdere muskel engraftment og regenerering. Videre disse eksperimentene tydelig kontrast med de som fullførte i mus, der pre-skade av muskel med Cardiotoxin eller bariumklorid kreves to dager før engraftment 30,31. Det er sannsynlig at nålen skade som produseres under transplantasjon prosedyre potenserer innpoding ved å stimulere produksjonen av en regenerativ miljø innenfor mottakerens dyret 32,33. Vi ser også at vår metode vil være lett tilpasses til transplantasjon av skjelettmuskulatur vev fra yngre sebrafisk, slik vurdering av genetiske mutasjoner som påvirker tidlig skjelettmuskelutviklingmen føre til dødelighet på larvestadiet.
Vi har også gitt en detaljert protokoll for engraftment av sebrafisk ERMS ved intraperitoneal injeksjon i non-condition, rag2 homozygot mutant fisk. Denne fremgangsmåten var nyttig for utvidelse av doble transgene primære tumorer uten behov for generering av tumorer i en syngenisk transgen linje. Vår nylig arbeid har vist at celletransplantasjonsfremgangsmåter tilveiebringe nye eksperimentelle modeller for å vurdere ERMS medikamentsensitivitet in vivo, hvor en enkelt svulst kan utvides inn tusener av dyr og bedømt for effekter på veksten, selvfornyelse, og neovaskularisering 15. Dessuten har vi lykkes innpodet et bredt spekter av svulster i rag2 homozygot mutant fisk inkludert T-celle akutt lymfatisk leukemi, melanom, og ERMS 23. Ser mot fremtiden ser vi for oss disse linjene vil være nyttig for å vurdere viktige funksjonelle egenskaper til kreft ivivo herunder vurdere intra-tumor heterogenitet, invasjon, metastase, angiogenese, og terapi motstand. Videre vil generering av rag2 homozygot mutant fisk i optisk klart Casper belastning sebrafisk 34 sannsynlig rette direkte avbildning av mange av disse kjennetegnene ved kreft.
Totalt gir vi detaljerte protokoller for vellykket engraftment av fluoresceinmerkede normal og ondartet skjelettmuskulatur i til voksen rag2 homozygot mutant immun kompromittert sebrafisk.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet støttes av Alex 'Lemonade Stand Foundation (DML), American Cancer Society (DML), MGH Howard Goodman Fellowship (DML), og amerikanske National Institutes of Health gir R24OD016761 og 1R01CA154923 (DML). CNY flowcytometrisystemer Core og Flow Bildeanalyse, delt instrumentering stipend nummer 1S10RR023440-01A1. IMT er finansiert av et fellesskap fra den portugisiske Foundation for Science and Technology (Fundação para en Ciencia e Tecnologia – FCT). QT er finansiert av Kina Scholarship Council. Vi takker Angela Volorio for hennes nyttige innspill og råd.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Tris-EDTA buffer solution 1x | Sigma-Aldrich | 93283-100ML | microinjection. Injection mix. |
Potassium Chloride | Fisher Science Education | S77375-1 | microinjection. Injection mix. |
XhoI Restriction Enzyme | New England Biolabs | R0146S | microinjection. Plasmid linearization. |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 (50) or 28106 (250) | Microinjection. For purification of linearized plasmid up to 10 kb. |
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol | Fisher Scientific | BP1753I-100 | Microinjection. For purification of linearized plasmid. |
UltraPure Agarose, 500 g | Invitrogen | 16500-500 | microinjection. Linearized plasmid quantification. |
Nanodrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | http://www.nanodrop.com/Productnd2000overview.aspx | microinjection. Linearized plasmid quantification. |
DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole,dihydrochloride) | Life Technologies | D1306 | flow cytometry/FACS |
5 ml polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352058 | flow cytometry collection tube |
BD FACSAria II | BD Biosciences | Special Order Research Products (SORP) program | FACS |
5 ml polypropylene round bottom tube | BD Falcon | 352063 | FACS collection tube |
BD LSR II | BD Biosciences | Special Order Research Products (SORP) program | flow cytometry |
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X) | Life Technologies | 10010-023 | Transportation |
Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-01 | Transportation |
Tricaine methanesulphonate (MS-222) | Western Chemical Inc. | http://www.wchemical.com/tricaine-s-ms-222.html | Transportation. Anesthetic. Caution: Irritant. Irritating to eyes, respiratory system, and skin. |
VWR Absorbent Bench Underpads | VWR | 56616-018 | Transportation. Regular paper towels or sponge can be used as an alternative |
Singe Edge Industrial Razor Blades | VWR | 55411-050 | Transportation |
Petri Dish, Polystryrene Disposable Sterile | VWR | 25384-302 | Transportation |
Cell Strainer, 40 µm Nylon | Falcon-Corning Incorporated | 352340 | Transportation |
50 mL Centrifuge Tube | Corning Incorporated | 430828 | Transportation |
Trypan Blue Stain (0.4%) | Life Technologies | 15250-061 | Transportation |
Hemacytometer Set | Hausser Scientific | 1483 | Transportation |
Hamilton syringe, fixed needle, volume 10 µL, needle size 26s ga (bevel tip) | Hamilton | 80366 | Transportation |
Austin's A-1 Bleach, Commercial | James Austin Company | Transportation. Any commercial solution can be used | |
Ethanol 190 Proof | Decon Labs, Inc. | DSP-MD.43 | Microinjection (linearized plasmid purification) and Transportation. Any commercial solution can be used |
High Speed Microcentrifuge, 300D Digital Microcentrifuge | Denville Scientific Inc. | C0265-24 | Transportation |
Sorvall Legend XFR Centrifuge | Thermo Scientific | 75004539 | Transportation. Catalog number for 120V, 60Hz (US) |
5 ml serological pipets | BD Falcon | 357529 | Transportation |
Corning Stripettor Plus Pipetting Controller | Corning Incorporated | 4090 | Transportation. Any automatic pipetting controller can be used |
Powder free examination gloves | All steps. Any commercial brand can be used | ||
Filter pipet tips and micropipettes | All steps. Any commercial brand can be used | ||
Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11205-20 | Transportation |
Fluorescent Stereomicroscope | Olympus | MVX10 | Scoring. Any appropriate fluorescent stereomicroscope can be used |
Olympus DP72 microscope digital camera | Olympus | DP72 | Scoring. Multiple adequate cameras for the selected imaging system can be used. |