Here, we present a protocol for cell transplantation of zebrafish skeletal muscle and embryonal rhabdomyosarcoma (ERMS) into adult immune compromised rag2E450fs homozygous mutant zebrafish. This protocol allows for the efficient analysis of regeneration and malignant transformation of muscle cells.
Zebrafisk er blevet et stærkt værktøj til vurdering af udvikling, regenerering, og kræft. Mere for nylig er allograft celletransplantation protokoller blevet udviklet, som tillader inkorporering af normale og maligne celler i bestrålede syngene og immunsvækkede voksen zebrafisk. Disse modeller når kombineret med optimerede celletransplantationstjenester protokoller giver mulighed for hurtig vurdering af stamceller funktion, regenerering efter skade, og kræft. Her præsenterer vi en metode til celle transplantation af zebrafisk voksen skeletmuskulatur og embryonal rhabdomyosarcoma (ERMS), en pædiatrisk sarkom, der deler træk med embryonale muskel, i immun kompromitteret voksen rag2 E450fs homozygot mutant zebrafisk. Det er vigtigt, disse dyr mangler T-celler og har reduceret B-celle funktion, lette indpodning af en lang række af væv fra uafhængige donordyr. Vores optimerede protokoller viser, at fluorescens-mærket muskelceller prepartioner fra α-actin-RFP transgene zebrafisk indpode håndfast når implanteret i den dorsale muskulaturen rag2 homozygot mutant fisk. Vi demonstrerer også indpodning af fluorescerende-transgene ERMS hvor fluorescens er begrænset til celler baseret på differentiering status. Specifikt blev ERMS oprettet i AB-stammen myf5-GFP, mylpfa-mCherry dobbelt transgene dyr og tumorer injiceret i bughinden af voksne immunsvækkede fisk. Anvendeligheden af disse protokoller omfatter indpodning af en lang række af normale og maligne donorceller, som kan implanteres i dorsal muskulatur eller peritoneum voksen zebrafisk.
Zebrafisk er en fremragende model til regenerativ undersøgelser, fordi de kan regenerere amputeret finner, samt en beskadiget hjerne, retina, rygmarv, hjerte, skeletmuskel og andre væv 1. Stamcelle og regenererende studier i voksne zebrafisk har i vid udstrækning fokuseret på karakterisering af regenerering som reaktion på skade, mens identifikation af stamceller og stamceller fra forskellige væv ved celle transplantation er først for nylig blevet udforsket 2. Zebrafisk er også blevet mere og mere brugt til studiet af kræft ved produktion af transgene kræftmodeller der efterligner menneskelig sygdom 3-10.
Ved fastsættelsen af kræft, har celletransplantationstjenester tilgange bliver udbredt og tillade dynamisk vurdering af vigtige cancer processer, herunder selvfornyelse 11, funktionel heterogenitet 12,13, neovaskularisering 14, spredning,terapi svar 15 og invasion 16,17. Imidlertid er indpodede celler ofte afvist fra modtageren fisk på grund vært immunforsvar, der angriber og dræber implantatet 18. Adskillige fremgangsmåder er blevet anvendt til at overvinde afvisning af indpodede celler. For eksempel kan modtageren dyr immunsystemet være forbigående ablateres af lavdosis gamma-bestråling før transplantation 18,19. Dog vil modtageren immunsystem komme med 20 dage efter bestråling og dræbe donorceller 18. Alternativt er dexamethasonbehandling blevet brugt til at undertrykke T og B-celle-funktion, hvilket giver længere immunundertrykkende konditionering og lette indpodning af en lang række humane tumorer i op til 30 dage 14. Disse eksperimenter kræver konstant lægemiddeldosering og er begrænset til at undersøge af faste tumorer. Engraftment på lang sigt assays har brugt genetisk identiske syngene linjer 20-22, hvor donor og recipiskellige celler er immune matchet. Disse modeller kræver dog, transgene linjer af interesse, der skal krydses ind i syngene baggrund for mere end fire generationer til at producere fuldt syngene linjer. For at undgå problemer med immunafstødning i modtageren fisk har vores gruppe for nylig udviklet en immunkompromitteret rag2 E450fs homozygot mutant (ZFIN allelbetegnelse rag2 fb101) linje, der har reduceret T- og B-celle funktion, og som tillader inkorporering af en lang række af væv 23. Lignende immun kompromitteret musemodeller har været brugt i udstrakt grad til celle transplantation af mus og humane væv 24.
Her præsenterer vi metoder til transplantation af skeletmuskulatur og embryonal rhabdomyosarcoma (ERMS), en pædiatrisk sarkom, der deler træk med skeletmuskulatur, i den nyligt beskrevne rag2 homozygot mutant zebrafisk. Tilgængeligheden af en immun kompromitteret voksen zebrafiskudvider vores evne til at udføre store celletransplantationstjenester undersøgelser direkte visualisere og vurdere stamcelle selvfornyelse inden for normale og maligne væv. Med denne metode, fluorescensmærket muskel cellepræparater fra voksne α-actin-RFP 25 transgene zebrafisk robust indpode i rag2 homozygot mutant zebrafisk efter injektion i den dorsale muskulatur. Desuden har vi demonstrere engraftment og udvidelse af primær myf5 -GFP; mylpfa- mCherry transgene ERMS efter intraperitoneal injektion i rag2 E450fs homozygot mutant zebrafisk. Nytten af disse protokoller går ud over de viste eksempler og kan nemt påføres yderligere zebrafisk regenerative væv og kræft.
Effektiv og robust indpodning af voksne dorsale skeletmuskulatur blev opnået med en meget enkel cellepræparation metode efterfulgt af injektion af celler i dorsale muskulaturen rag2 homozygot mutant fisk. Generelt intramuskulær injektion procedurer var meget robust, med nogle tilhørende død umiddelbart efter implantation procedure, der spænder fra 10% til 35% afhængig af eksperimentet. Yderligere optimering vil sandsynligvis koncentrere sig om udnyttelse af mindre gauge nåle til injektion og udvikling af apparatur stationære injektion ved mikroskopi og mikromanipulator, hvilket vil lette nem implantere celler. Vores tilgang også brugt usorterede muskelceller fra donordyr og kun indeholdt ca. 30% muskel stamceller. Anvendelse af transgene reporter linier, som mærker stamceller og FACS isolation vil sandsynligvis give berigede cellesuspensioner, der fører til øget indpodning i modtageren fisk. Skeletmuskel calen kan også beriges og dyrkes før transplantation, som tidligere beskrevet 29. Bemærkelsesværdigt, vores resultater viser også, at de trin niche etablering og differentiering af donor muskelvæv ske før 10 dage efter transplantationen, oprettelse denne model som en robust og hurtig eksperimentel platform til at vurdere muskel engraftment og regeneration. Desuden disse eksperimenter skarp kontrast til dem, afsluttet i mus, hvor pre-skade muskler med cardiotoxin eller bariumchlorid kræves to dage forud for transplantation 30,31. Det er sandsynligt, at nålen er produceret under transplantation procedure potenserer indpodning ved at stimulere produktionen af en regenerativ miljø i den modtagende dyr 32,33. Vi forestiller også, at vores metode vil let tilpasses til transplantation af skeletmuskulatur væv fra yngre zebrafisk, hvilket man kan vurdere genetiske mutationer, der påvirker tidlige skeletmuskulatur udviklingmen fører til dødelighed hos larvestadier.
Vi har også givet en detaljeret protokol for indpodning af zebrafisk ERMS ved intraperitoneal injektion i ikke-condition, rag2 homozygot mutant fisk. Denne fremgangsmåde er nyttig til ekspansion af dobbelt transgene primære tumorer uden behov for at frembringe tumorer i en syngen transgen linje. Vores seneste arbejde har vist, at celletransplantationstjenester tilgange tilvejebringe nye eksperimentelle modeller til vurdering ERMS lægemiddelfølsomhed in vivo, hvor en enkelt tumor kan udvides i tusindvis af dyr og vurderet for virkningerne på vækst, selv-fornyelse, og neovaskularisering 15. Endvidere har vi med succes indpodet en bred vifte af tumorer i rag2 homozygot mutant fisk, herunder T-celle akut lymfoblastisk leukæmi, melanom, og ERMS 23. Ser mod fremtiden, vi forestiller disse linjer vil være nyttige for vurderingen af vigtige funktionelle egenskaber af kræft ivivo, herunder vurdering intratumoral heterogenitet, invasion, metastase, angiogenese og modstand terapi. Desuden vil genereringen af rag2 homozygot mutant fisk i optisk klare Casper stamme zebrafisk 34 sandsynligvis lette den direkte billeddannelse af mange af disse kendetegnende for kræft.
I alt giver vi detaljerede protokoller for en vellykket transplantation af fluorescens-mærkede normal og malign skeletmuskel i til voksne rag2 homozygot mutant immun kompromitteret zebrafisk.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde understøttes af Alex 'Lemonade Stand Foundation (DML), American Cancer Society (DML), MGH Howard Goodman Fellowship (DML), og amerikanske National Institutes of Health giver R24OD016761 og 1R01CA154923 (DML). CNY flowcytometri Core og Flow billedanalyse, fælles instrumentering tilskud nummer 1S10RR023440-01A1. IMT er finansieret af et stipendium fra det portugisiske Foundation for Videnskab og Teknologi (Fundação para a Ciência e Tecnologia – FCT). QT er finansieret af Kina Scholarship Rådet. Vi takker Angela Volorio for hendes nyttige kommentarer og råd.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Tris-EDTA buffer solution 1x | Sigma-Aldrich | 93283-100ML | microinjection. Injection mix. |
Potassium Chloride | Fisher Science Education | S77375-1 | microinjection. Injection mix. |
XhoI Restriction Enzyme | New England Biolabs | R0146S | microinjection. Plasmid linearization. |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 (50) or 28106 (250) | Microinjection. For purification of linearized plasmid up to 10 kb. |
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol | Fisher Scientific | BP1753I-100 | Microinjection. For purification of linearized plasmid. |
UltraPure Agarose, 500 g | Invitrogen | 16500-500 | microinjection. Linearized plasmid quantification. |
Nanodrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | http://www.nanodrop.com/Productnd2000overview.aspx | microinjection. Linearized plasmid quantification. |
DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole,dihydrochloride) | Life Technologies | D1306 | flow cytometry/FACS |
5 ml polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352058 | flow cytometry collection tube |
BD FACSAria II | BD Biosciences | Special Order Research Products (SORP) program | FACS |
5 ml polypropylene round bottom tube | BD Falcon | 352063 | FACS collection tube |
BD LSR II | BD Biosciences | Special Order Research Products (SORP) program | flow cytometry |
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X) | Life Technologies | 10010-023 | Transportation |
Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-01 | Transportation |
Tricaine methanesulphonate (MS-222) | Western Chemical Inc. | http://www.wchemical.com/tricaine-s-ms-222.html | Transportation. Anesthetic. Caution: Irritant. Irritating to eyes, respiratory system, and skin. |
VWR Absorbent Bench Underpads | VWR | 56616-018 | Transportation. Regular paper towels or sponge can be used as an alternative |
Singe Edge Industrial Razor Blades | VWR | 55411-050 | Transportation |
Petri Dish, Polystryrene Disposable Sterile | VWR | 25384-302 | Transportation |
Cell Strainer, 40 µm Nylon | Falcon-Corning Incorporated | 352340 | Transportation |
50 mL Centrifuge Tube | Corning Incorporated | 430828 | Transportation |
Trypan Blue Stain (0.4%) | Life Technologies | 15250-061 | Transportation |
Hemacytometer Set | Hausser Scientific | 1483 | Transportation |
Hamilton syringe, fixed needle, volume 10 µL, needle size 26s ga (bevel tip) | Hamilton | 80366 | Transportation |
Austin's A-1 Bleach, Commercial | James Austin Company | Transportation. Any commercial solution can be used | |
Ethanol 190 Proof | Decon Labs, Inc. | DSP-MD.43 | Microinjection (linearized plasmid purification) and Transportation. Any commercial solution can be used |
High Speed Microcentrifuge, 300D Digital Microcentrifuge | Denville Scientific Inc. | C0265-24 | Transportation |
Sorvall Legend XFR Centrifuge | Thermo Scientific | 75004539 | Transportation. Catalog number for 120V, 60Hz (US) |
5 ml serological pipets | BD Falcon | 357529 | Transportation |
Corning Stripettor Plus Pipetting Controller | Corning Incorporated | 4090 | Transportation. Any automatic pipetting controller can be used |
Powder free examination gloves | All steps. Any commercial brand can be used | ||
Filter pipet tips and micropipettes | All steps. Any commercial brand can be used | ||
Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11205-20 | Transportation |
Fluorescent Stereomicroscope | Olympus | MVX10 | Scoring. Any appropriate fluorescent stereomicroscope can be used |
Olympus DP72 microscope digital camera | Olympus | DP72 | Scoring. Multiple adequate cameras for the selected imaging system can be used. |