Here, we present a protocol for cell transplantation of zebrafish skeletal muscle and embryonal rhabdomyosarcoma (ERMS) into adult immune compromised rag2E450fs homozygous mutant zebrafish. This protocol allows for the efficient analysis of regeneration and malignant transformation of muscle cells.
Zebrafisk har blivit ett kraftfullt verktyg för att bedöma utvecklingen, förnyelse, och cancer. På senare tid har allograft celltransplantationsprotokoll utvecklats som tillåter inympning av normala och maligna celler i bestrålas, syngena, och nedsatt immunförsvar vuxna zebrafisk. Dessa modeller när den kombineras med optimerade celltransplantationsprotokoll möjliggör snabb bedömning av stamcellsfunktion, regeneration efter skada, och cancer. Här presenterar vi en metod för celltransplantation av zebrafisk vuxen skelettmuskel och embryonal rabdomyosarkom (ERMS), en pediatrisk sarkom som delar drag med embryonala muskler, till nedsatt immunförsvar vuxen rag2 E450fs homozygot mutant zebrafisk. Viktigt är dessa djur saknar T-celler och har nedsatt B-cell-funktion, vilket underlättar inympning av ett brett spektrum av vävnader från obesläktade givardjur. Våra optimerade protokollen visar att fluorescensmärkt muskelcell preparsamheten från α-aktin-RFP transgen zebrafisk ympas kraftigt när implanteras i ryggmuskulaturen för rag2 homozygot mutant fisk. Vi visar även inympning av fluorescerande-transgen ERMS där fluorescens är begränsad till celler baserat på differentieringsstatus. Specifikt ERMS skapades i AB-stammen myf5-GFP; mylpfa-mCherry dubbeltransgena djur och tumörer injicerades i peritoneum hos vuxna immun äventyras fisk. Användbarheten av dessa protokoll omfattar inympning av ett brett spektrum av normala och maligna donatorceller som kan implanteras i dorsala muskulatur eller peritoneum hos vuxna zebrafisk.
Zebrafisk är en utmärkt modell för regenerativa studier eftersom de kan regenerera amputerade fenor, såväl som en skadad hjärna, retina, ryggmärg, hjärta, skelettmuskel och andra vävnader 1. Stamcells och regenerativ studier i vuxenzebrafisk har till stor del fokuserat på karakterisering av förnyelse som svar på skada, medan identifiering av stamceller och progenitorceller från olika vävnader genom celltransplantation har först nyligen undersökts 2. Zebrafisk har också blivit allt använt för studien av cancer genom generering av transgena cancermodeller som efterliknar människosjukdom 3-10.
I inställningen av cancer, har celltransplantations metoder blir allmänt antagits och tillåta den dynamiska bedömningen av viktiga cancerprocesser inklusive självförnyelse 11, funktionell heterogenitet 12,13, kärlnybildning 14, spridning,terapisvar 15, och invasion 16,17. Men engrafted cellerna ofta avvisas från mottagaren fisk pga värd immunförsvar som angriper och dödar transplantatet 18. Flera metoder har använts för att övervinna avstötning av engrafted celler. Till exempel kan de mottagande djuren immunförsvar vara övergående ablateras med låg dos gammastrålning före transplantation 18,19. Dock kommer mottagaren immunsystemet återhämtar med 20 dagar efter bestrålning och döda givarceller 18. Alternativt har dexametason behandling använts för att hämma T- och B-cellsfunktion, vilket ger längre immun suppressiv konditionering och underlättar inympning av ett brett spektrum av humana tumörer under upp till 30 dagar 14. Dessa experiment kräver ständig läkemedelsdosering och är begränsade för att studera av solida tumörer. Långsiktiga transplantations analyser har använt genetiskt identiska syngena linjerna 20-22, där givaren och recipient celler är immuna matchas. Men dessa modeller kräver transgena linjer av intresse som ska korsas in i syngena bakgrund för mer än fyra generationer att producera fullt syngena linjer. För att undanröja problem av immunavstötning hos mottagaren fisk, har vår grupp nyligen utvecklat en immun äventyras rag2 E450fs homozygot mutant (ZFIN allel beteckning rag2 fb101) linje som har minskat T-cellsfunktion och B och som tillåter inympning av ett brett spektrum av vävnader 23. Liknande immun äventyras musmodeller har använts i stor utsträckning för celltransplantation av mus och mänskliga vävnader 24.
Här presenterar vi metoder för transplantation av skelettmuskulaturen och embryonal rabdomyosarkom (ERMS), en pediatrisk sarkom som delar drag med skelettmuskel, till det nyligen beskrivna rag2 homozygot mutant zebrafisk. Tillgängligheten av en immun äventyras vuxen zebrafiskutökar vår förmåga att utföra storskaliga celltransplantationsstudier för att direkt visualisera och utvärdera stamcellssjälvförnyelse inom normala och maligna vävnader. Med denna metod, fluorescensmärkt preparat muskelcell från vuxen α-aktin-RFP 25 transgen zebrafisk robust inympa i rag2 homozygot mutant zebrafisk efter injektion i ryggmuskulaturen. Dessutom visar vi inympning och expansion av primär myf5 -GFP; mylpfa- mCherry transgena ERMS efter intraperitoneal injektion i rag2 E450fs homozygot mutant zebrafisk. Nyttan av dessa protokoll går utöver de exempel som visas och kan lätt appliceras på ytterligare zebrafisk regenerativa vävnader och cancer.
Effektiv och robust inympning av vuxenryggskelettmuskel uppnåddes med en mycket enkel beredning cellmetod följt av injektion av celler i ryggmuskulaturen för rag2 homozygot mutant fisk. Generellt injektion intramuskulär förfaranden var mycket robust, med några tillhörande döden omedelbart efter implantationen förfarandet, från 10% till 35% beroende på experimentet. Ytterligare optimering kommer sannolikt att koncentreras på utnyttjande av mindre nålar för injektion och utveckling av stationära injektionsapparat med ett mikroskop och mikromanipulator, vilket kommer att underlätta enkel implantera celler. Vårt tillvägagångssätt används också osorterade muskelceller från donatordjur och endast innehöll ungefär 30% muskel progenitorceller. Användning av transgena reporter linjer som märka stamceller och FACS isolering kommer sannolikt att ge anrikade cellsuspensioner som leder till ökad engraftment in mottagarens fisk. Skelettmuskel calnar skulle också kunna berikas och odlas före transplantation, såsom tidigare beskrivits 29. Anmärkningsvärt, våra resultat visar också att stegen nisch etablering och differentiering av donator muskelvävnad ske innan 10 dagar efter transplantation, upprättande denna modell som en robust och snabb experimentell plattform för att bedöma muskel engraftment och förnyelse. Dessutom är dessa experiment brutalt kontrast med dem avslutades i möss, där det krävs förhands skada av muskler med cardiotoxin eller bariumklorid två dagar före engraftment 30,31. Det är troligt att nålskada producerats under transplantationen förfarandet potentierar engraftment genom att stimulera produktionen av en regenerativ miljö inom mottagardjuret 32,33. Vi ser framför oss också att vår metod lätt kommer att anpassas till transplantation av skelettmuskulaturen vävnad från yngre zebrafisk, vilket gör bedömningen av genetiska mutationer som påverkar tidiga skelettmuskelutvecklingmen leder till dödlighet i larvstadierna.
Vi har också ett detaljerat protokoll för inympning av zebrafisk ERMS genom intraperitoneal injektion i icke-rade, rag2 homozygot mutant fisk. Detta tillvägagångssätt var användbart för expansion av dubbeltransgena primära tumörer utan behov av att alstra tumörer inom en syngen transgen linje. Vårt senaste arbete har visat att celltransplantations metoder tillhandahålla nya experimentella modeller för att bedöma ERMS läkemedelskänslighet in vivo, där en enda tumör kan utökas till tusentals djur och bedömas för effekter på tillväxt, självförnyelse och kärlnybildning 15. Dessutom har vi framgångsrikt engrafted ett brett spektrum av tumörer in rag2 homozygot mutant fisk inklusive T-cell akut lymfoblastisk leukemi, melanom och ERMS 23. Ser mot framtiden, föreställer vi oss dessa linjer kommer att vara användbar för att bedöma viktiga funktionella egenskaper av cancer ivivo inklusive bedömning intratumoral heterogenitet, invasion, metastas, angiogenes, och terapi motstånd. Dessutom kommer alstringen av rag2 homozygot mutant fisk i den optiskt klara Casper stam zebrafisk 34 sannolikt underlätta direkt avbildning av många av dessa kännetecken cancer.
Totalt ger vi detaljerade protokoll för den framgångsrika inympning av fluorescensmärkta normala och maligna skelettmuskel i till vuxen rag2 homozygot mutant immun äventyras zebrafisk.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av Alex Lemonade Stand Foundation (DML), American Cancer Society (DML), den MGH Howard Goodman Fellowship (DML), och amerikanska National Institutes of Health beviljar R24OD016761 och 1R01CA154923 (DML). CNY flödescytometri Core och Flow bildanalys, delad instrumentering licensnummer 1S10RR023440-01A1. IMT finansieras av ett stipendium från den portugisiska Stiftelsen för vetenskap och teknik (Fundação para en Ciência e Tecnologia – FCT). QT finansieras av Kina stipendium rådet. Vi tackar Angela Volorio för hennes hjälp kommentarer och råd.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Tris-EDTA buffer solution 1x | Sigma-Aldrich | 93283-100ML | microinjection. Injection mix. |
Potassium Chloride | Fisher Science Education | S77375-1 | microinjection. Injection mix. |
XhoI Restriction Enzyme | New England Biolabs | R0146S | microinjection. Plasmid linearization. |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 (50) or 28106 (250) | Microinjection. For purification of linearized plasmid up to 10 kb. |
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol | Fisher Scientific | BP1753I-100 | Microinjection. For purification of linearized plasmid. |
UltraPure Agarose, 500 g | Invitrogen | 16500-500 | microinjection. Linearized plasmid quantification. |
Nanodrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | http://www.nanodrop.com/Productnd2000overview.aspx | microinjection. Linearized plasmid quantification. |
DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole,dihydrochloride) | Life Technologies | D1306 | flow cytometry/FACS |
5 ml polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352058 | flow cytometry collection tube |
BD FACSAria II | BD Biosciences | Special Order Research Products (SORP) program | FACS |
5 ml polypropylene round bottom tube | BD Falcon | 352063 | FACS collection tube |
BD LSR II | BD Biosciences | Special Order Research Products (SORP) program | flow cytometry |
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X) | Life Technologies | 10010-023 | Transportation |
Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-01 | Transportation |
Tricaine methanesulphonate (MS-222) | Western Chemical Inc. | http://www.wchemical.com/tricaine-s-ms-222.html | Transportation. Anesthetic. Caution: Irritant. Irritating to eyes, respiratory system, and skin. |
VWR Absorbent Bench Underpads | VWR | 56616-018 | Transportation. Regular paper towels or sponge can be used as an alternative |
Singe Edge Industrial Razor Blades | VWR | 55411-050 | Transportation |
Petri Dish, Polystryrene Disposable Sterile | VWR | 25384-302 | Transportation |
Cell Strainer, 40 µm Nylon | Falcon-Corning Incorporated | 352340 | Transportation |
50 mL Centrifuge Tube | Corning Incorporated | 430828 | Transportation |
Trypan Blue Stain (0.4%) | Life Technologies | 15250-061 | Transportation |
Hemacytometer Set | Hausser Scientific | 1483 | Transportation |
Hamilton syringe, fixed needle, volume 10 µL, needle size 26s ga (bevel tip) | Hamilton | 80366 | Transportation |
Austin's A-1 Bleach, Commercial | James Austin Company | Transportation. Any commercial solution can be used | |
Ethanol 190 Proof | Decon Labs, Inc. | DSP-MD.43 | Microinjection (linearized plasmid purification) and Transportation. Any commercial solution can be used |
High Speed Microcentrifuge, 300D Digital Microcentrifuge | Denville Scientific Inc. | C0265-24 | Transportation |
Sorvall Legend XFR Centrifuge | Thermo Scientific | 75004539 | Transportation. Catalog number for 120V, 60Hz (US) |
5 ml serological pipets | BD Falcon | 357529 | Transportation |
Corning Stripettor Plus Pipetting Controller | Corning Incorporated | 4090 | Transportation. Any automatic pipetting controller can be used |
Powder free examination gloves | All steps. Any commercial brand can be used | ||
Filter pipet tips and micropipettes | All steps. Any commercial brand can be used | ||
Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11205-20 | Transportation |
Fluorescent Stereomicroscope | Olympus | MVX10 | Scoring. Any appropriate fluorescent stereomicroscope can be used |
Olympus DP72 microscope digital camera | Olympus | DP72 | Scoring. Multiple adequate cameras for the selected imaging system can be used. |