Desenvolvimento de um Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Ensaio com um controlo positivo interno
Summary
Provided is a protocol for developing a real-time recombinase polymerase amplification assay to quantify initial concentration of DNA samples using either a thermal cycler or a microscope and stage heater. Also described is the development of an internal positive control. Scripts are provided for processing raw real-time fluorescence data.
Abstract
It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to quantify DNA sample concentration using a standard curve. In this manuscript, a detailed protocol for developing and implementing a real-time quantitative recombinase polymerase amplification assay (qRPA assay) is provided. Using HIV-1 DNA quantification as an example, the assembly of real-time RPA reactions, the design of an internal positive control (IPC) sequence, and co-amplification of the IPC and target of interest are all described. Instructions and data processing scripts for the construction of a standard curve using data from multiple experiments are provided, which may be used to predict the concentration of unknown samples or assess the performance of the assay. Finally, an alternative method for collecting real-time fluorescence data with a microscope and a stage heater as a step towards developing a point-of-care qRPA assay is described. The protocol and scripts provided may be used for the development of a qRPA assay for any DNA target of interest.
Introduction
Quantitativo de amplificação de ácido nucleico é uma técnica importante para a detecção do meio ambiente, de origem alimentar, e agentes patogénicos de origem da água, bem como para diagnósticos clínicos. Em tempo real da reacção em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) é o método padrão de ouro para a detecção sensível, específico, e quantitativa de ácidos nucleicos, por exemplo, para o HIV-1 de teste de carga virai, a detecção de agentes patogénicos bacterianos, e rastreio para muitos outros organismos 1 – 3. Durante qPCR em tempo real, os iniciadores de amplificação de ADN patógeno em ciclos, e um sinal de fluorescência que é gerada é proporcional à quantidade de ADN amplificado na amostra em cada ciclo. Uma amostra contendo uma concentração desconhecida de DNA agente patogénico pode ser quantificada utilizando uma curva padrão que relaciona a concentração inicial de ADN de amostras padrão e a hora em que o sinal fluorescente atinge um determinado limiar (ou seja, o ciclo limiar, C ou T).
<p class="Jove_content"> Porque qPCR em tempo real requer equipamento caro ciclos térmicos e várias horas, para receber os resultados de amplificação isotérmica técnicas alternativas, tais como a amplificação com polimerase recombinase (APR), têm sido desenvolvidos 4. Estas plataformas geralmente proporcionar resultados mais rápidos e amplificar ácidos nucleicos em, uma única temperatura mais baixa, que pode ser realizada com equipamento menos dispendioso, mais simples. RPA, o que é particularmente atractivo para aplicações de ponto de cuidados, amplifica o DNA em minutos, exige uma temperatura baixa de amplificação (37 ° C), e permanece activa na presença de impurezas de 5,6. Ensaios de RPA foram desenvolvidos para uma ampla gama de aplicações, incluindo a análise de alimentos, detecção de agentes patogénicos, o rastreio de fármacos do cancro, e a detecção de agentes biothreat 7-12. No entanto, o uso de RPA para a quantificação de ácidos nucleicos tem sido limitada 13,14.Em trabalhos anteriores, foi shown que em tempo real quantitativo RPA (qRPA) é viável 15. Aqui, um protocolo mais detalhada é fornecida para a utilização em tempo real para quantificar a RPA quantitativa amostras desconhecidas utilizando uma curva padrão, um método que é análogo à quantificação utilizando qPCR. Este protocolo descreve como realizar uma reacção de APR num termociclador para detectar ADN do VIH-1 como uma prova de conceito, bem como desenvolver um controlo positivo interno (IPC) para assegurar está a funcionar adequadamente no sistema. A coleta de dados usando um termociclador ou microscópio e análise de dados para a construção de uma curva padrão, utilizando dados de treinamento também é detalhado. Por fim, o método para quantificar amostras desconhecidas por meio de curva padrão com um script personalizado é demonstrada. Esta técnica permite qRPA quantificação de amostras com concentrações desconhecidas e tem muitas vantagens em relação a tempo real tradicional qPCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
A fim de obter dados de quantificação significativas usando o algoritmo MATLAB, o usuário deve selecionar os valores de entrada apropriados quando solicitado. Depois de iniciar cada script nos pontos 5 e 6, todas as variáveis de entrada são automaticamente solicitado na janela de comandos e saídas são gerados automaticamente. Na Seção 5.7 o usuário é solicitado a selecionar um limite de inclinação. O valor do limiar de inclinação afecta o quadrado do coeficiente de correlação (r2) do en…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi financiada por uma bolsa da Fundação Bill & Melinda Gates através dos Grandes Desafios em Iniciativa de Saúde Global.
Materials
| qRPA Assay | |||
| Supply | Vendor | Part number | Comments/Description |
| HIV-1 forward primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3’ |
| HIV-1 reverse primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3’ |
| HIV-1 probe | BioSearch Technologies | custom DNA oligos | 5’- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3’ |
| IPC probe | BioSearch Technologies | custom DNA oligos | 5’-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3’ |
| RPA exo reagents (pellets, rehydration buffer, magnesium acetate | TwistDx | TwistAmp exo | |
| PCR tube strips | BioRad | TLS0801 | |
| PCR flat cap tube strips | BioRad | TCS0803 | |
| Micro-seal adhesive | BioRad | 558/MJ | |
| HIV-1 target (pHIV-IRES- eYFPΔEnvΔVifΔVpr) | custom plasmid, see: Segall, H. I., Yoo, E. & Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range. Molecular Therapy 8, 118–129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003). | ||
| Human male genomic DNA | Applied Biosystems | 360486 | |
| 96 well cold-block | Cole Parmer | EW-36700-48 | |
| Thermal cycler | BioRad | CFX96 | |
| MiniFuge | VWR | 93000-196 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 | |
| Tris buffer 1.0 M, pH 8.0 | EMD Millipore | 648314 | |
| EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Promega | V4321 | |
| Nuclease free water | Ambion | AM9937 | |
| IPC Development | |||
| Supply | Vendor | Part number | Comments/Description |
| Cryptosporidium parvum IPC template | Waterborne Inc | P102C | It is also possible to order a double stranded synthetic target from IDT if the user is unequipped to work with C. parvum (a BSL-2 infectious agent). PCR and RPA primers for C. parvum were designed using GenBank accession number AF115377.1 |
| PCR long forward primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3’ |
| PCR long reverse primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3’ |
| Phusion High-Fidelty DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| TAE 10X buffer | EMD Millipore | 574797 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
| Microscope Experiments | |||
| Supply | Vendor | Part number | Comments/Description |
| Upright fluorescence microscope | Zeiss | Zeiss Imager.J1 | |
| Stage heater | Bioscience Tools | TC-GSH | |
| 1-Channel Precision High Stability Temperature Controller | Bioscience Tools | TC-1100S | |
| FAM/GFP filter cube | Zeiss | filter set 38 (000000-1031-346) | excitation BP 470/40 nm, emission BP 520/50 nm |
| HEX filter cube | Chroma | 49014 | excitation BP 530/30 nm, emission BP 575/40 nm |
| Laser cutter | Engraver's Network | VLS3.60 | |
| 1/8" black acrylic | McMaster Carr | 8505K113 | |
| 1.5 mm clear acrylic | McMaster Carr | PD-72268940 | |
| Super glue | Office Depot | Duro super glue | |
| PCR grade mineral oil | Sigma Aldrich | M8662-5VL | |
| Data Analysis | |||
| Software | Vendor | ||
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| MATLAB | MATLAB | ||
| MATLAB script: "JoVE_qRPA_standard_curve.m” | Included in SI | ||
| MATLAB script: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m” | Included in SI | ||
| MATLAB script: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m” | Included in SI | ||
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| JoVE_qRPA_well.ai | Included in SI | ||
| JoVE_qRPA_base.ai | Included in SI | ||
| AxioVision software | Zeiss | ||
| JoVE_AxioVision_Script.ziscript | Included in SI |
Riferimenti
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