LEPR<sup> DB</sup> 2型糖尿病のマウスモデル：無傷の膵島の膵島単離およびライブセル2光子イメージング
Summary
We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.
Abstract
2型糖尿病は、過去20年の間に、2型糖尿病におけるβ細胞機能不全の役割が明確に2を確立されている。2013年382万人に影響を与える慢性疾患であり、2035年15.92億に上昇すると予想されます。研究の進歩は、膵島の単離のための方法が必要でした。野生型および糖尿病LEPR デシベル （DB / DB）マウスの両方から分離された膵島の収量と品質を向上させるためにいくつかの変更を加えて、ここでは他のグループからのプロトコルと共有多くの共通の手順を提示膵島単離のプロトコル。生細胞2光子イメージング方法は、次いで、膵島内のインスリン分泌の制御を研究するために使用することができるが提示されます。
Introduction
疾患におけるβ細胞機能不全の役割が広く3,4認識されています。このようなMIN6及びINS-1などの細胞株は、β細胞の挙動の生物学を理解するための便利なツールです。しかし、インスリン分泌の生理学的制御は、ランゲルハンス島内で起こります。これらの島は密に詰まったβ細胞の数千、ならびに血管および他の内分泌細胞型を含みます。膵島内のこの環境は、インスリン分泌に影響を与え、糖尿病において重要である可能性があります。したがって、インスリン分泌の生理学的制御、および疾患の病態生理を理解するためには、無傷島を研究することが必須です。
膵島単離
ヒト膵島ライブ及び、特に、2型糖尿病患者からのヒト膵島を得ることが困難です。また、ヒト膵島は、実験分子操作のための限られた可能性があります。研究者はそのためである使用してきました動物や2型糖尿病の動物モデルからすることができます。そのような疾患モデルは、DB / dbマウスです。これは、モデルが密接にヒトの疾患5,6と平行した表現型の進行と2型糖尿病自然突然変異です。糖尿病のdb / dbマウスの膵島単離のためにここで紹介するプロトコルは、より良好な収率、精製および強化された膵島の生存のためのいくつかの改良と、他のグループと共通の多くのステップがあります。
2光子イメージング
生細胞2光子アッセイは、ここで説明した数を定量化し、糖尿病7の多くの細胞および野生型の島8,9から単一のインスリン含有顆粒の特性を評価するために研究者を可能にします。
Protocol
Representative Results
Discussion
膵島単離の中で最も重要な要因は、膵臓の初期灌流です。かなり低い膵島収量の灌流膵臓結果の下に。他の要因も、このような消化時間と部分的に灌流のレベルを補うことができる振とうのレベルとして分離の質に影響を与えます。例えば、完全に灌流膵臓を静かに振盪しながら下には、膵臓が困難に振盪しながら〜20分の消化を必要とする可能性が消化対照的に、18分30秒〜37℃でインキュ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by an Australian Research Council Grant DP110100642 (to PT) and National Health and Medical Research Council Grants APP1002520 and APP1059426 (to PT and HYG).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Liberase TL 5mg | Roche | -5401020001 | |
| Collagenase type IV-1g | Gibco-Life Technologies | 17104-019 | |
| Histopaque 1077 500ml | Sigma Aldrich | 10771 | |
| RPMI 1640 Medium (10X) 1L | Sigma Aldrich | R1383 | to prepare isolation media |
| RPMI 1640 (1X) 500ml | Gibco-Life Technologies | 21870-076 | to prepare cultured media |
| Penicillin-Streptomycin 100ml | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | to prepare cultured media |
| Fetal bovine serum 500ml | Gibco-Life Technologies | 10099-141 | to prepare cultured media |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco-Life Technologies | 11966-025 | to dilute the liberase |
| Metamorph program | Molecular Devices, USA | to analyze the 2-photon images |
References
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