الكشف عن أهداف ميرنا في إنتاجية عالية باستخدام الفحص 3'LIFE
Summary
Luminescent identification of functional elements in 3’ untranslated regions (3’UTRs) (3’LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3’UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.
Abstract
الانارة تحديد عناصر وظيفية في 3'UTRs (3'LIFE) يسمح للالتحديد السريع للأهداف miRNAs محددة ضمن مجموعة من مئات 3'UTRs الاستعلام. ويستند تحديد الهدف على الفحص المزدوج luciferase المراسل، الذي يكتشف ملزمة على مستوى مرنا من خلال قياس الناتج متعدية، وإعطاء قراءات الوظيفية ميرنا الاستهداف. يستخدم 3'LIFE مخازن غير مملوكة والكواشف، والمكتبات مراسل المتاحة علنا، مما يجعل شاشات الجينوم على نطاق مجدية وفعالة من حيث التكلفة. 3'LIFE لا يمكن أن يؤديها إما في مختبر تحديد معيار أو زيادتها باستخدام الروبوتات مناولة السائل وغيرها من الأجهزة عالية الإنتاجية. نحن لتوضيح النهج باستخدام بيانات من 3'UTRs بشرية مستنسخة في لوحات 96-جيدا، واثنين من miRNAs اختبار، واسمحوا-7C ومير 10B. ونحن لشرح كيفية تنفيذ إعداد DNA، ترنسفكأيشن، ثقافة الخلية والمقايسات luciferase المراسل في شكل 96-جيدا، وتوفير أدوات للبياناتتحليل. في الختام 3'LIFE هو تكرار للغاية، بسرعة وانتظام، ويحدد الأهداف ثقة عالية.
Introduction
الهدف العام من هذا الأسلوب هو الكشف عن وبدقة خريطة الرنا الميكروي (ميرنا) أهداف في الإنتاجية العالية. MiRNAs هي الذاتية الرنا غير المكودة ~ 22 النيوكليوتيدات في الطول. بعد النسخ والتجهيز، وتدرج miRNAs ناضجة في مجمع بروتين يسمى الحمض النووي الريبي التي يسببها إسكات المعقدة (RISC). كل ميرنا يوجه RISC لاستهداف العناصر الموجودة بشكل أساسي في المناطق 3'untranslated (3'UTRs) من الرنا المرسال (من mRNAs)، مما أدى إلى إما ترجمة القمع أو مرنا انشقاق 1. ميرنا تعترف المواقع المستهدفة على أساس معيار واتسون-كريك وG: U تمايل قاعدة الاقتران، وهي المنحطة في الطبيعة، والتي تحتوي على عدة أزواج قاعدة متطابقة والمناطق انتفخ. هي الحفاظ العديد من miRNAs على نطاق واسع من النباتات للإنسان 2،3، حيث أنها تلعب مجموعة متنوعة من الأدوار البيولوجية. في metazoans miRNAs يمكن أن تؤثر في العمليات الحيوية المتعددة بما في ذلك القرارات مصير الخلية 4، توقيت التنموي 5 </sup>، وكثيرا ما تظهر الأنسجة أنماط التعبير محددة 6،7. ميرنا misexpression يمكن أن يؤدي أيضا في تنظيم الجينات الشاذة، والتي يمكن أن يكون لها تأثير كبير على سلوك الخلية يعتمد فقط على وظيفة الجينات المستهدفة. على هذا النحو، وترتبط miRNAs لمجموعة واسعة من الأمراض، بما في ذلك التنكس العصبي 8،9 والسكري والسرطان 10 11. بيوينفورمتيك والنهج الرطب مقاعد البدلاء تشير إلى أن كل ميرنا قد تكون قادرة على استهداف مئات الآلاف من من mRNAs متميزة 14/12، مشيرا إلى أن ثمة حاجة لنهج الإنتاجية العالية أو الجينوم واسعة للتحقيق في هذا التجمع الكبير من التفاعلات المحتملة.
تحديد الجينات المستهدفة هو عنصر حاسم في تحديد وظيفة ميكانيكي ميرنا، والقيام بذلك يجب أن يكون الباحثون قادرين على كشف الأهداف على نطاق واسع. وقد وضعت عدة نهج لتحديد أهداف ميرنا، بما في ذلك خوارزميات التنبؤ بيوينفورمتيك، عالية الإنتاجية تسلسلمن المستهدف من mRNAs، ومراسل المقايسات القائمة. كل من هذه الأساليب لديها القوة ونقاط الضعف الكامنة. وبالنظر إلى أن يسترشد استهداف ميرنا التي كتبها خصوصية التسلسل، وعلى الأخص من النيوكليوتيدات 2-6 من ميرنا (وهو ما يسمى المنطقة البذور)، وقد وضعت عدة خوارزميات التنبؤ أهداف ميرنا في جميع أنحاء الجينوم للعديد من الكائنات الحية. ويتم تدريب هذه الخوارزميات باستخدام الملاحظة الزخارف قاعدة الاقتران أهداف ميرنا التحقق من صحتها، وكثيرا ما تستخدم المعلمات مثل الاقتران صرامة البذور، والحفاظ على الموقع، و / أو الاستقرار الحرارية 15. في حين أن هذه الفلاتر صقل العدد الكبير من الأهداف المفترضة مع التكامل كافية لأهداف ثقة عالية فحسب، بل قد استبعاد الأنواع المواقع المستهدفة ميرنا محددة وغير متعارف عليها، والتي تشير أدلة حديثة واسعة الانتشار 16-24. وعلاوة على ذلك، فإن هذه التوقعات لا تأخذ في الاعتبار آليات المعالجة مرنا التي تستبعد المواقع المستهدفة ميرنا، مثل تذييل بعديد الأدينيلات البديل25، والتحرير RNA 26، RNA مثيلة 27، وملزم التعاونية. على هذا النحو، تم الإبلاغ عن ارتفاع معدلات الإيجابية الكاذبة والسلبية الكاذبة للعديد من خوارزميات 22،24،28. في حين أن هذه الخوارزميات هي مفيدة لتحديد أهداف ميرنا مرشح للالتحقق التجريبي لاحق، وهذه معدلات الخطأ عالية تحد من فعالية النهج بيوينفورمتيك لمنهجية الكشف عن الهدف ميرنا.
للتحقيق منهجي للتفاعل بين ميرنا معين و3'UTRs يحتمل أن تكون مستهدفة قمنا بتطوير فحص عالية الإنتاجية دعا الفلورسنت تحديد عناصر وظيفية في 3'UTRs (3'LIFE) 24. يقيس هذا الاختبار التفاعل المباشر والقمع متعدية للاختبار 3'UTR بواسطة استعلام ميرنا باستخدام نظام luciferase المراسل المزدوج. في هذا النظام، يتم استنساخ 3'UTR من الجينات في المصالح المصب من يراعة luciferase المراسل (fluc) مراسل قراءة الإطار. سلبيات مراسلوcotransfected truct مع استعلام ميرنا في الخلايا HEK293T. يتم تحديد استهداف ميرنا عن طريق قياس التغير النسبي بين اختبار fluc :: مراسل 3'UTR ومراسل Renilla luciferase المراسل غير محددة الثاني. الأهم من ذلك، المقايسات luciferase المراسل كشف الوظيفية التفاعلات ميرنا / مرنا التي تؤثر على الانتاج متعدية لمراسل. هذا هو ميزة رئيسية على الطرق التقليدية للكشف عن تنظيم ميرنا، مثل RT-QPCR والبقع الغربية، في أن هذا يتجاوز الاختلافات في تدهور مرنا والقمع متعدية، فضلا عن التغيرات في وفرة البروتين مستقلة لتنظيم 3'UTR القائمة.
وتستخدم على نطاق واسع المقايسات luciferase المراسل للتحقق أهداف ميرنا مباشرة بسبب بساطتها النسبية والحساسية، ومع ذلك فإن استخدامها في شاشات عالية الإنتاجية محدودة بسبب ارتفاع التكاليف المرتبطة الكواشف الاستهلاكية، وعدم وجود مكتبات 3'UTR من مصادر عامة، وغياب من موحد luciferase المراسل بروتocols، مما يؤدي إلى صعوبات في المقارنة بين القمع وظيفية عبر قواعد بيانات متعددة. لتسهيل استخدام فحص 3'LIFE، وضعنا التركيز على تبسيط التصميم التجريبي، والاستفادة من ترنسفكأيشن 24 و luciferase المراسل الكواشف غير التجارية 29، إنشاء مكتبة 3'UTR التي يتم تحديثها بانتظام وتوسيع نطاقها، ويتوفر من خلال مستودع البلازميد العام 30.
قابلية للفحص 3'LIFE يسمح فحص مكتبة 3'UTR كبيرة لاستهداف من قبل ميرنا معين دون يتحامل على الشاشة نحو الجينات التي تم تحديدها bioinformatically. بالإضافة إلى اختبار التفاعلات الكنسي وتوقع، وهذا نهج منظم يسمح بتحديد أهداف جديدة مدفوعة عن طريق التفاعلات غير متعارف عليها و / أو أنواع محددة. الأهم من ذلك، هو فهم تأثير ميرنا تستهدف على إنتاج البروتين عموما أن يؤدي إلى قمع متعدية متواضع 15،31 </ سوب>، مما يدل على أن الدور الأساسي للتنظيم ميرنا هو لضبط الانتاج البروتين، وحماية ضد المستويات الشاذة في التعبير الجيني، وتوفير قوة إلى الخلية برامج محددة 32،33. حساسية مقايسة luciferase المراسل جنبا إلى جنب مع عدد كبير بطبيعتها التفاعلات ميرنا / مرنا السلبية في الشاشة 3'LIFE تتيح الكشف عن آثار خفية من ميرنا تستهدف على عدد كبير من الجينات، وتحديد عناصر متعددة من شبكات الجين الذي وينظم معين ميرنا 24.
نحن هنا تصف البروتوكول 3'LIFE، وإظهار انها جدوى عن طريق فحص اثنين من miRNAs جيدا اتسم مير 10B ودع غيرك 7C ضد فريق من 275 3'UTRs الإنسان (الشكل 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
ويحدد الفحص 3'LIFE أهداف ميرنا وظيفية في 3'UTRs في الإنتاجية العالية. هذا الاختبار هو مفيد للباحثين الذين يرغبون في التعرف على التجربة عددا كبيرا من الأهداف المفترضة لميرنا اهتمامهم. مقايسة 3'LIFE هو نهج قوي للاستعلام عن تنظيم مدفوعة 3'UTR، في هذا يوفر فحص مقياس الوظيف…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Stephen Blazie, Karen Anderson, Josh LaBaer for advice and discussion. Karen Anderson, John Chaput, and Josh LaBaer for sharing reagents and instrumentation, Michael Gaskin and Andrea Throop for technical advise and protocols. Justin Wolter is a Maher scholar and thanks the Maher family for their generous support.
Materials
| Reagents | ||
| glycylglycine | Sigma | G1127-25G |
| Kx PO4 | Sigma | P2222 |
| EGTA | Sigma | E3889 |
| ATP | Sigma | FLAAS |
| DTT | Sigma | D0632 |
| MgSO4 | Sigma | M7506 |
| CoA | Sigma | C4282 |
| luciferin | Sigma | L9504 |
| NaCl | Sigma | S7653 |
| Na2EDTA | Sigma | E0399 |
| K H2 P O4 | Sigma | 1551139 |
| BSA | Sigma | A2153 |
| NaN3 | Sigma | S2002 |
| Coelenterazine | Sigma | C3230 |
| PBS/HEPES | Corning | 21-040-CV |
| DMEM | Sigma | D5546 |
| FBS | Sigma | F2442 |
| Pennicilin/Streptomicin | Sigma | P4333 |
| Trypsin | T2600000 | |
| Consumables | ||
| MaxiPrep Kit | Promega | A2392 |
| 96-well miniprep plate | Pall | 8032 |
| 96-well shuttle plates | Lonza | V4SP-2096 |
| 5x Lysis Buffer | Promega | E1941 |
| Instruments | ||
| 96-well GloMax Plate Reader | Promega | E9032 |
| Biomech FX Liquid Handler Robot | Beckmann | A31842 |
| 4D-Nucleofector Core Unit | Lonza | AAF-1001 |
| 96-well Shuttle System | Lonza | AAM-1001 |
| Cell Counter Countess | Invitrogen | C10227 |
Riferimenti
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Pasquinelli, A. E., et al. Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA. Nature. 408 (6808), 86-89 (2000).
- Reinhart, B. J., Weinstein, E. G., Rhoades, M. W., Bartel, B., Bartel, D. P. MicroRNAs in plants. Genes Dev. 16 (13), 1616-1626 (2002).
- Ivey, K. N., et al. MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 2 (3), 219-229 (2008).
- Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
- Wienholds, E., et al. MicroRNA expression in zebrafish embryonic development. Science. 309 (5732), 310-311 (2005).
- Darnell, D. K., et al. MicroRNA expression during chick embryo development. Dev Dyn. 235 (11), 3156-3165 (2006).
- Jin, P., Alisch, R. S., Warren, S. T. RNA and microRNAs in fragile X mental retardation. Nat Cell Biol. 6 (11), 1048-1053 (2004).
- Kim, J., et al. A MicroRNA feedback circuit in midbrain dopamine neurons. Science. 317 (5842), 1220-1224 (2007).
- Poy, M. N., et al. A pancreatic islet-specific microRNA regulates insulin secretion. Nature. 432 (7014), 226-230 (2004).
- Calin, G. A., Croce, C. M. MicroRNA signatures in human cancers. Nature Reviews Cancer. 6 (11), 857-866 (2006).
- Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).
- Paraskevopoulou, M. D., et al. DIANA-microT web server v5.0: service integration into miRNA functional analysis workflows. Nucleic Acids Res. 41 (Web Server issue), W169-W173 (2013).
- Krek, A., et al. Combinatorial microRNA target predictions. Nat Genet. 37 (5), 495-500 (2005).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
- Vella, M. C., Choi, E. Y., Lin, S. Y., Reinert, K., Slack, F. J. The C. elegans microRNA let-7 binds to imperfect let-7 complementary sites from the lin-41 3’UTR. Genes Dev. 18 (2), 132-137 (2004).
- Lal, A., et al. miR-24 Inhibits cell proliferation by targeting E2F2, MYC, and other cell-cycle genes via binding to ‘seedless’ 3’UTR microRNA recognition elements. Molecular Cell. 35 (5), 610-625 (2009).
- Cevec, M., Thibaudeau, C., Plavec, J. N. M. R. NMR structure of the let-7 miRNA interacting with the site LCS1 of lin-41 mRNA from Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 38 (21), 7814-7821 (1093).
- Shin, C., et al. Expanding the microRNA targeting code: functional sites with centered pairing. Molecular Cell. 38 (6), 789-802 (2010).
- Azzouzi, I., et al. MicroRNA-96 directly inhibits gamma-globin expression in human erythropoiesis. PLoS One. 6 (7), e22838 (2011).
- Chen, J., et al. miR-193b Regulates Mcl-1 in Melanoma. Am J Pathol. 179 (5), 2162-2168 (2011).
- Chi, S. W., Hannon, G. J., Darnell, R. B. An alternative mode of microRNA target recognition. Nat Struct Mol Biol. 19 (3), 321-327 (1038).
- Jiao, L. R., et al. MicroRNAs targeting oncogenes are down-regulated in pancreatic malignant transformation from benign tumors. PLoS One. 7 (2), e32068 (2012).
- Wolter, J. M., Kotagama, K., Pierre-Bez, A. C., Firago, M., Mangone, M. 3’LIFE: a functional assay to detect miRNA targets in high-throughput. Nucleic Acids Res. , (2014).
- Mangone, M., et al. The landscape of C. elegans 3’UTRs. Science. 329 (5990), 432-435 (2010).
- Ekdahl, Y., Farahani, H. S., Behm, M., Lagergren, J., Ohman, M. A-to-I editing of microRNAs in the mammalian brain increases during development. Genome Res. 22 (8), 1477-1487 (2012).
- Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m(6)A RNA methylation. Nat Rev Genet. 15 (5), 293-306 (2014).
- Zhou, P., et al. Large-scale screens of miRNA-mRNA interactions unveiled that the 3’UTR of a gene is targeted by multiple miRNAs. Plos One. 8 (7), e68204 (2013).
- Dyer, B. W., Ferrer, F. A., Klinedinst, D. K., Rodriguez, R. A noncommercial dual luciferase enzyme assay system for reporter gene analysis. Anal Biochem. 282 (1), 158-161 (2000).
- Seiler, C. Y., et al. DNASU plasmid and PSI:Biology-Materials repositories: resources to accelerate biological research. Nucleic Acids Res. , (2013).
- Baek, D., et al. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 455 (7209), 64-71 (2008).
- Ebert, M. S., Sharp, P. A. Roles for MicroRNAs in Conferring Robustness to Biological Processes. Cell. 149 (3), 515-524 (2012).
- Pelaez, N., Carthew, R. W. Biological robustness and the role of microRNAs: a network perspective. Current Topics in Developmental Biology. 99, 237-255 (2012).
