Påvisning av miRNA Targets i High-throughput Bruke 3'LIFE analysen
Summary
Luminescent identification of functional elements in 3’ untranslated regions (3’UTRs) (3’LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3’UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.
Abstract
Lysende Identifikasjon av funksjonelle elementer i 3'UTRs (3'LIFE) tillater rask identifisering av mål av spesifikke mirnas innenfor en rekke av hundrevis av spørres 3'UTRs. Target identifikasjon er basert på den doble luciferase-assay, som detekterer bindings på mRNA-nivå ved å måle translatorisk utgang, noe som gir en funksjonell avlesing av miRNA målretting. 3'LIFE bruker ikke-proprietære buffere og reagenser, og offentlig tilgjengelige reporter biblioteker, noe som gjør genom-wide skjermer gjennomførbare og kostnadseffektive. 3'LIFE kan utføres enten i en standard lab innstilling eller skaleres opp ved hjelp av flytende håndtering roboter og andre high-throughput instrumentering. Vi illustrerer tilnærming ved hjelp av et datasett av humane 3'UTRs klonet inn i 96-brønners plater, og to test mirnas, la-7c og Mir-10B. Vi demonstrerer hvordan man skal utføre DNA-preparat, transfeksjon, cellekultur og luciferase-assays i 96-brønners-formatet, og tilbyr verktøy for dataanalyse. I konklusjonen 3'LIFE reproduserbar, rask, systematisk, og identifiserer høye tillit mål.
Introduction
Det overordnede målet med denne metoden er å oppdage og presist kart mikroRNA (miRNA) mål i høy gjennomstrømming. Mirnas er endogene ikke-kodende RNA ~ 22 nukleotider i lengde. Etter transkripsjon og behandling, er modne mirnas innlemmet i et protein kompleks kalt RNA indusert stanse kompleks (RISC). Hver miRNA styrer RISC å målrette heter som befinner seg hovedsakelig i 3'untranslated regioner (3'UTRs) av messenger RNA (mRNA), som resulterer i enten oversettelse undertrykkelse eller mRNA spalting 1. Mirna gjenkjenne målwebområder basert på standard Watson-Crick og G: U vingle baseparing, og er degenerert i naturen, som inneholder flere feilaktige basepar og bulte regioner. Mange mirnas er bredt bevart fra planter til mennesker 2,3, der de spiller en rekke ulike biologiske roller. I metazoans mirnas kan påvirke flere biologiske prosesser, inkludert celle skjebne beslutninger 4, utviklings timing 5 </sup>, Og ofte oppvise vev spesifikke uttrykk mønstre 6,7. Mirna misexpression kan også føre til avvikende genregulering, som kan ha vesentlig innflytelse på celle atferd basert utelukkende på funksjonen av målgener. Som sådan, er mirnas knyttet til en rekke sykdommer, inkludert nevrodegenerasjon 8,9, diabetes 10 og 11 cancer. Bioinformatiske og våt-benk tilnærminger antyder at hver miRNA kan være i stand til å målrette hundrevis til tusenvis av forskjellige mRNA 12-14, noe som indikerer at high-throughput eller genom brede tilnærminger er nødvendig for å undersøke dette store antall potensielle interaksjoner.
Identifisere mål gener er en kritisk komponent i mechanistically definere miRNA funksjon, og å gjøre det forskere må kunne avsløre mål på en stor skala. Flere metoder har blitt utviklet for å identifisere miRNA mål, inkludert bioinformatiske prediksjon algoritmer, high-throughput sekvensemålrettet mRNA, og reporter baserte analyser. Hver av disse metodene har iboende styrker og svakheter. Gitt at miRNA målretting er styrt av sekvens spesifisitet, særlig av nukleotider 2-6 av miRNA (betegnet frøet region), flere algoritmer har blitt utviklet for å forutsi miRNA mål i hele genomet av mange organismer. Disse algoritmene er trent med de observerte base sammenkobling motiver av validerte miRNA mål, og ofte benytter parametre som strengere frø sammenkobling, site bevaring, og / eller termodynamisk stabilitet 15. Mens disse filtrene avgrense det store antall mulige mål med tilstrekkelig komplementaritet å bare høye tillit mål, kan de utelukke artsspesifikke og ikke-kanoniske miRNA målwebområder, som nylig overveiende sannsynlig er utbredt 16-24. Videre gjør disse spådommene ikke ta hensyn mekanismer for mRNA behandling som utelukker miRNA målwebområder som alternativ polyadenylerings25, RNA redigering 26, RNA metylering 27, og samarbeidende binding. Som sådan, har høye falske positive og falske negative prisene blitt rapportert for mange algoritmer 22,24,28. Mens disse algoritmene er nyttige for å identifisere kandidat miRNA mål for påfølgende eksperimentell validering, disse høye feilrater begrense effekten av bioinformatiske metoder for systematisk miRNA måldeteksjon.
Å systematisk undersøke for interaksjoner mellom et gitt miRNA og potensielt målrettede 3'UTRs har vi utviklet en high-throughput analysen heter Luminescerende Identifikasjon av funksjonelle elementer i 3'UTRs (3'LIFE) 24. Denne analysen måler direkte interaksjoner og translasjonsforskning undertrykkelse av test 3'UTR av en spørring miRNA bruker doble luciferase reporter system. I dette systemet, er 3'UTR av et gen av interesse klonet nedstrøms for ildflue luciferase (Fluc) reporter leseramme. Reporteren construct kotransfekteres med en spørring miRNA i HEK293T celler. Mirna målretting bestemmes ved å måle den relative endringen mellom test Fluc :: 3'UTR reporter og en andre ikke-spesifikk Renilla luciferase reporter. Viktigere, luciferase assays detektere funksjonelle miRNA / mRNA vekselvirkninger som påvirker den translatoriske produksjonen av reporteren. Dette er en viktig fordel i forhold til tradisjonelle metoder for å oppdage miRNA regulering, slik som RT-qPCR og Western blot, i at dette omgår forskjeller i mRNA fornedrelse og translasjonsforskning undertrykkelse, samt endringer i protein overflod uavhengig av 3'UTR basert regulering.
Luciferase-analyser er utbredt benyttet for å validere miRNA direkte mål på grunn av sin relative enkelhet og følsomhet, men deres bruk i high-throughput-skjermer er begrenset av høye kostnader i forbindelse med forbruk reagenser, mangel på 3'UTR biblioteker fra offentlige kilder, og fraværet av standardiserte luciferase protocols, som fører til vanskeligheter i å sammenligne funksjonelle undertrykkelse på tvers av flere datasett. For å forenkle bruken av 3'LIFE analysen, har vi lagt vekt på forenkling av eksperimentell design, bruk av ikke-kommersielle transfeksjonsteknikker 24 og luciferasereagenser 29, noe som skaper en 3'UTR bibliotek som er jevnlig oppdatert og utvidet, og er tilgjengelig gjennom en offentlig plasmid depot 30.
Den skalerbarhet av 3'LIFE analysen tillater screening av et stort 3'UTR bibliotek for målretting av en gitt miRNA uten forspenning av skjermen mot bioinformatically identifisert gener. I tillegg til å teste kanoniske og spådd interaksjoner, gir dette systematisk identifisering av nye mål drevet via ikke-kanoniske og / eller artsspesifikke interaksjoner. Viktigst er effekten av miRNA målretting på proteinproduksjon generelt forstått å resultere i beskjeden translasjonsforskning undertrykkelse 15,31 </ Sup>, noe som tyder på at en primær rolle miRNA regulering er å finjustere protein utgang, beskytte mot avvikende nivåer av genekspresjon, og gi robusthet til celle spesifikke programmer 32,33. Følsomheten av luciferase-assay kombinert med iboende stort antall negative miRNA / mRNA-interaksjoner i 3'LIFE skjermen tillater påvisning av effekter av subtile miRNA rettet på et stort antall gener, og identifisering av flere komponenter av gen nettverk som er regulert av en gitt miRNA 24.
Her beskriver vi 3'LIFE protokollen, og demonstrere det er gjennomførbart ved screening to godt karakteriserte mirnas, Mir-10b og la-7c mot et panel av 275 menneske 3'UTRs (figur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Den 3'LIFE analysen identifiserer funksjonelle miRNA mål i 3'UTRs i høy gjennomstrømming. Denne analysen er nyttig for forskere som ønsker å eksperimentelt identifisere et stort antall av mulige mål for deres miRNA av interesse. Den 3'LIFE-analysen er en kraftig metode for å spørre etter 3'UTR drevet regulering, ved at analysen gir et funksjonelt mål på miRNA målretting, og den binære testing av en enkelt reporter :: 3'UTR mot et enkelt miRNA kan trygt håndtere målrettingen statusen til…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Stephen Blazie, Karen Anderson, Josh LaBaer for advice and discussion. Karen Anderson, John Chaput, and Josh LaBaer for sharing reagents and instrumentation, Michael Gaskin and Andrea Throop for technical advise and protocols. Justin Wolter is a Maher scholar and thanks the Maher family for their generous support.
Materials
| Reagents | ||
| glycylglycine | Sigma | G1127-25G |
| Kx PO4 | Sigma | P2222 |
| EGTA | Sigma | E3889 |
| ATP | Sigma | FLAAS |
| DTT | Sigma | D0632 |
| MgSO4 | Sigma | M7506 |
| CoA | Sigma | C4282 |
| luciferin | Sigma | L9504 |
| NaCl | Sigma | S7653 |
| Na2EDTA | Sigma | E0399 |
| K H2 P O4 | Sigma | 1551139 |
| BSA | Sigma | A2153 |
| NaN3 | Sigma | S2002 |
| Coelenterazine | Sigma | C3230 |
| PBS/HEPES | Corning | 21-040-CV |
| DMEM | Sigma | D5546 |
| FBS | Sigma | F2442 |
| Pennicilin/Streptomicin | Sigma | P4333 |
| Trypsin | T2600000 | |
| Consumables | ||
| MaxiPrep Kit | Promega | A2392 |
| 96-well miniprep plate | Pall | 8032 |
| 96-well shuttle plates | Lonza | V4SP-2096 |
| 5x Lysis Buffer | Promega | E1941 |
| Instruments | ||
| 96-well GloMax Plate Reader | Promega | E9032 |
| Biomech FX Liquid Handler Robot | Beckmann | A31842 |
| 4D-Nucleofector Core Unit | Lonza | AAF-1001 |
| 96-well Shuttle System | Lonza | AAM-1001 |
| Cell Counter Countess | Invitrogen | C10227 |
Riferimenti
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Pasquinelli, A. E., et al. Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA. Nature. 408 (6808), 86-89 (2000).
- Reinhart, B. J., Weinstein, E. G., Rhoades, M. W., Bartel, B., Bartel, D. P. MicroRNAs in plants. Genes Dev. 16 (13), 1616-1626 (2002).
- Ivey, K. N., et al. MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 2 (3), 219-229 (2008).
- Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
- Wienholds, E., et al. MicroRNA expression in zebrafish embryonic development. Science. 309 (5732), 310-311 (2005).
- Darnell, D. K., et al. MicroRNA expression during chick embryo development. Dev Dyn. 235 (11), 3156-3165 (2006).
- Jin, P., Alisch, R. S., Warren, S. T. RNA and microRNAs in fragile X mental retardation. Nat Cell Biol. 6 (11), 1048-1053 (2004).
- Kim, J., et al. A MicroRNA feedback circuit in midbrain dopamine neurons. Science. 317 (5842), 1220-1224 (2007).
- Poy, M. N., et al. A pancreatic islet-specific microRNA regulates insulin secretion. Nature. 432 (7014), 226-230 (2004).
- Calin, G. A., Croce, C. M. MicroRNA signatures in human cancers. Nature Reviews Cancer. 6 (11), 857-866 (2006).
- Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).
- Paraskevopoulou, M. D., et al. DIANA-microT web server v5.0: service integration into miRNA functional analysis workflows. Nucleic Acids Res. 41 (Web Server issue), W169-W173 (2013).
- Krek, A., et al. Combinatorial microRNA target predictions. Nat Genet. 37 (5), 495-500 (2005).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
- Vella, M. C., Choi, E. Y., Lin, S. Y., Reinert, K., Slack, F. J. The C. elegans microRNA let-7 binds to imperfect let-7 complementary sites from the lin-41 3’UTR. Genes Dev. 18 (2), 132-137 (2004).
- Lal, A., et al. miR-24 Inhibits cell proliferation by targeting E2F2, MYC, and other cell-cycle genes via binding to ‘seedless’ 3’UTR microRNA recognition elements. Molecular Cell. 35 (5), 610-625 (2009).
- Cevec, M., Thibaudeau, C., Plavec, J. N. M. R. NMR structure of the let-7 miRNA interacting with the site LCS1 of lin-41 mRNA from Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 38 (21), 7814-7821 (1093).
- Shin, C., et al. Expanding the microRNA targeting code: functional sites with centered pairing. Molecular Cell. 38 (6), 789-802 (2010).
- Azzouzi, I., et al. MicroRNA-96 directly inhibits gamma-globin expression in human erythropoiesis. PLoS One. 6 (7), e22838 (2011).
- Chen, J., et al. miR-193b Regulates Mcl-1 in Melanoma. Am J Pathol. 179 (5), 2162-2168 (2011).
- Chi, S. W., Hannon, G. J., Darnell, R. B. An alternative mode of microRNA target recognition. Nat Struct Mol Biol. 19 (3), 321-327 (1038).
- Jiao, L. R., et al. MicroRNAs targeting oncogenes are down-regulated in pancreatic malignant transformation from benign tumors. PLoS One. 7 (2), e32068 (2012).
- Wolter, J. M., Kotagama, K., Pierre-Bez, A. C., Firago, M., Mangone, M. 3’LIFE: a functional assay to detect miRNA targets in high-throughput. Nucleic Acids Res. , (2014).
- Mangone, M., et al. The landscape of C. elegans 3’UTRs. Science. 329 (5990), 432-435 (2010).
- Ekdahl, Y., Farahani, H. S., Behm, M., Lagergren, J., Ohman, M. A-to-I editing of microRNAs in the mammalian brain increases during development. Genome Res. 22 (8), 1477-1487 (2012).
- Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m(6)A RNA methylation. Nat Rev Genet. 15 (5), 293-306 (2014).
- Zhou, P., et al. Large-scale screens of miRNA-mRNA interactions unveiled that the 3’UTR of a gene is targeted by multiple miRNAs. Plos One. 8 (7), e68204 (2013).
- Dyer, B. W., Ferrer, F. A., Klinedinst, D. K., Rodriguez, R. A noncommercial dual luciferase enzyme assay system for reporter gene analysis. Anal Biochem. 282 (1), 158-161 (2000).
- Seiler, C. Y., et al. DNASU plasmid and PSI:Biology-Materials repositories: resources to accelerate biological research. Nucleic Acids Res. , (2013).
- Baek, D., et al. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 455 (7209), 64-71 (2008).
- Ebert, M. S., Sharp, P. A. Roles for MicroRNAs in Conferring Robustness to Biological Processes. Cell. 149 (3), 515-524 (2012).
- Pelaez, N., Carthew, R. W. Biological robustness and the role of microRNAs: a network perspective. Current Topics in Developmental Biology. 99, 237-255 (2012).
