خط أنابيب سريعة وموثوق بها للدراسة وتحليل الحالات البكتيرية Transcriptome على: تنظيم الجينات سيرين التي تعتمد في<em> العقدية الرئوية</em
Summary
This manuscript describes the use of state-of-the-art technology provided by DNA-microarrays. Microarrays provide an overview of the transcriptomic changes in bacteria incurred under a specific condition. Moreover, we highlight the ease by which large amounts of data can be analyzed by using convenient in-house developed software packages.
Abstract
التعبير الجيني وتنظيمه مهمة جدا لفهم سلوك الخلايا تحت ظروف مختلفة. وتستخدم تقنيات مختلفة في الوقت الحاضر لدراسة التعبير الجيني، ولكن معظم تقتصر من حيث توفير صورة شاملة للتعبير عن Transcriptome على كله. ميكروأرس DNA تقدم تكنولوجيا البحث السريعة والاقتصادية، والذي يعطي لمحة كاملة عن التعبير الجيني العالمي ولها عدد كبير من التطبيقات بما في ذلك تحديد جينات جديدة وعامل النسخ المواقع، وتوصيف النشاط النسخي من الخلايا، وكذلك ملزمة مساعدة في تحليل آلاف من الجينات (في تجربة واحدة). في هذه الدراسة، وقد تم تحسين الظروف لتحليل Transcriptome على البكتيريا من حصاد الخلايا لتحليل ميكروأري الحمض النووي. مع الأخذ بعين الاعتبار الوقت والتكاليف ودقة من التجارب، هذا النظام التكنولوجي يبرهن على أن تكون مفيدة جدا وapplicabale عالميا لدراسة transcripto بكتيريازارة التربية والعلم. هنا، ونحن أداء تحليل ميكروأري الحمض النووي مع العقدية الرئوية بمثابة دراسة حالة عن طريق مقارنة استجابات النسخي من S. الرئوية نمت في وجود تركيزات متفاوتة-L سيرين في المتوسط. تم عزل الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام طريقة Macaloid باستخدام عدة عزل الحمض النووي الريبي ونوعية RNA تم فحص باستخدام عدة RNA فحص الجودة. تم إعداد [كدنا باستخدام الناسخ العكسي وصفت العينات [كدنا باستخدام واحدة من اثنين من الأمينات رد الفعل الأصباغ الفلورية. واستخدمت محلية الصنع DNA الشرائح ميكروأري لالتهجين من العينات [كدنا] وصفت والبيانات ميكروأري تم تحليلها باستخدام إطار ما قبل معالجة البيانات ميكروأري [كدنا] (Microprep). وأخيرا، تم استخدام كاميرا Cyber-T لتحليل البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام Microprep لتحديد الجينات ذات دلالة إحصائية أعرب تفاضلي. حزم البرمجيات وعلاوة على ذلك، الذي بني في المنزل (الفلفل، FIVA، كشف، والمدعي العام وGenome2D) استخدمت لتحليلالبيانات.
Introduction
دراسة مجموعة كاملة من مرنا وفرة (Transcriptome على) المشفرة بواسطة الجينوم للكائنات وحيدة الخلية أو الخلايا حقيقية النواة في وقت محدد أو تحت شرط معين، بما في ذلك overexpression الجينات أو تدق التدريجي، ويسمى transcriptomics. Transcriptomics يسمح لنا أن نلاحظ أن ما يتم التعبير عن الجينات مدى تحت شرط معين في وقت نقطة X ويعطينا معلومات حول كيفية بقوة يتم التعبير عن الجينات نسبي إلى مرجع.
وميكروأري هو صفيف ثنائي الأبعاد على ركيزة صلبة (عادة شريحة زجاجية أو السيليكون الخلايا الرقيقة) التي يمكن استخدامها لفحص كميات كبيرة من المواد البيولوجية باستخدام فحص عالية الإنتاجية، والمنمنمة، وتجهيز المضاعفة والموازي والكشف الأساليب. ميكروأرس تأتي في أنواع مختلفة، بما في ذلك الحمض النووي ميكروأرس، ميكروأرس البروتين، ميكروأرس الببتيد، ميكروأرس الأنسجة، ميكروأرس الأجسام المضادة، ميكروأرس الخلوية وغيرها. وميكروأري الحمض النووي هوفي الأساس تجميع النقاط DNA المجهرية ثابتة على سطح صلب، عادة الزجاج. وتستخدم ميكروأرس الحمض النووي لقياس مستويات التعبير عن الجينات أو مجموعة من الجينات في وقت واحد أو في التركيب الوراثي مناطق متعددة من جينوم 2،3. Picomoles (10 -12 الشامات) من تحقيق موجودة في كل بقعة DNA الذي يمثل تسلسل الحمض النووي محددة، والمعروف أيضا كمراسلة. ويطلق على الجزيئات مرنا وصفت من عينات "أهداف". وتستخدم Fluorophores لقياس التهجين والكشف عن أهداف المسمى fluorophore التحقيق المستهدفة يحدد الوفرة النسبية للتسلسل الحمض النووي في الهدف. تجربة ميكروأري يمكن أن تنجز اختبارات جينية متعددة في نفس الوقت لأن مجموعة قد تحتوي على عشرات الآلاف من تحقيقات. يظهر تخطيط من تجربة ميكروأري بسيطة في الشكل 1. وفي الآونة الأخيرة، وقد تم تأسيسها في منطقتنا ومختبرات أخرى أن هذه المصفوفات قابلة لإعادة الاستخدام، الأمر الذي يجعل هذه التقنية تماما من حيث التكلفة فعاليهه.
وقد تم تطوير تقنيات عزل الحمض النووي الريبي وتنقية مختلفة على مر السنين بما في ذلك C-TAB، SDS وطرق GT 4-8. وعلاوة على ذلك، عدة مجموعات تجارية وتتوفر أيضا. للتعبير الجينات جودة عالية RNA مهم جدا. لذلك، يتم تعديل طرق عزل الحمض النووي الريبي للحصول على الكمية القصوى من الحمض النووي الريبي. وبالمثل، يتم الحد من الخطوات لإعداد [كدنا ووسم [كدنا]. يتم تنفيذ تطبيع البيانات بعد المسح أيضا بكفاءة عن طريق استخدام في المنزل بنيت حزم البرامج والأدوات 9.
العقدية الرئوية هو الممرض البشري الجرام الإيجابي الذي يستعمر البلعوم الأنفي وهو سبب إصابات متعددة مثل الالتهاب الرئوي وتعفن الدم، التهاب الأذن الوسطى والتهاب السحايا 10. بكتيريا يمكن الاستفادة تشكيلة واسعة من العناصر الغذائية اللازمة لنمو وبقاء 11،12. وقد أجريت عدد من الدراسات علىالأيض النيتروجين المكورات الرئوية والتنظيم مؤكدا على أهمية الأحماض الأمينية ودورها في الفوعة 13،14. في هذه الدراسة، واستجابة transcriptomic من S. الرئوية إلى تغيير تركيزات L-سيرين، وهو من الأحماض الأمينية موجودة بوفرة في بلازما الدم البشري، وأفادت باستخدام ميكروأرس الحمض النووي. رد transcriptomic من S. تم مقارنة الرئوية نمت في الحد الأدنى للتركيز L-سيرين (150 ميكرومتر) إلى أن تزرع في الحد الأقصى للتركيز (10 ملم) من سيرين. تم استخدام المتوسط محددة كيميائيا (CDM أو الحد الأدنى من المتوسط) 15 لهذه الدراسة للسيطرة على تركيز سيرين. محور هذه الدراسة هو جعل هذه التقنية سهلة الاستخدام وتوفير أدوات مختلفة للتطبيع البيانات وتحليلها. ولذلك، تم وضع عدد من الأدوات لتحليل وتفسير البيانات. FIVA (معلومات وظيفية عارض ومحلل) يوفر منبرا لمعالجة المعلومات الواردة في مجموعات من الجينات لهامماثلة أنماط التعبير الجيني وبناء التشكيلات الوظيفية 16. المدعي العام هو حزمة برامج أخرى تسهل تحديد المهام المفترضة وشروحه من الجينات 17. من خلال الاستفادة من طرق التجميع، كشف، يوفر ملزمة خوارزمية كشف الموقع DNA. الزخارف رابطة الدول المستقلة -regulatory من الجينات يمكن المتوقع باستخدام هذه الخوارزمية 18. تقدم Genome2D منصة يستند إلى Windows عن التصور وتحليل البيانات من خلال تقديم Transcriptome على نطاقات مختلفة الألوان لوصف التغيرات في مستويات التعبير الجيني على خريطة الجينوم 19. ويقدم خادم الفلفل، بالإضافة إلى أسلوب التحليل واحدة في كل و، مجموعة أدوات للتعدين لregulons والمروجين وعامل النسخ ملزمة المواقع 20. لا يمكن أن يتحقق الشرح الكامل من المناطق بين في الجينوم البكتيري باستخدام هذه الحزمة. يستطيع علماء الأحياء تستفيد كثيرا من الفلفل، حيث أنها توفر لهم منصة لتصميم التجربةالصورة بحيث يمكن تأكيد المعلومات المفترضة في المختبر 20. هذه حزم البرمجيات تساهم بشكل كبير في التحليل ميكروأري لأن معظمهم متاحة بحرية وجعل تطبيع البيانات وتحليلها موثوقة جدا.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن تصف بروتوكول سهلة الاستخدام التي يمكن تطبيقها لإجراء تحليل Transcriptome على كله من البكتيريا. والنقطة الأساسية حول هذه التقنية معينة هي أن حالة التي يتم بموجبها حصاد الخلايا سوف تختلف. بعد حصاد الخلايا والحمض النووي الريبي العزلة، تصبح هذه التقنية المتساوية لجميع أن?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر آن دي يونج وسيجير القابضة Holsappel للمساعدة في إنتاج الشرائح ميكروأرس الحمض النووي. كما تقدر دعم آن دي يونج لتحليل المعلوماتية الحيوية. كما نشكر جيلي Slager لمراجعة ورقة. معتمدة محمد أفضال وعرفان منصور من جامعة GC، فيصل آباد، باكستان في إطار برنامج تطوير أعضاء هيئة التدريس من HEC باكستان.
Materials
| Acid phenol | SigmaAldrich | P4682 | |
| Roche RNA isolation kit | Roche Applied Science | 11828665001 | |
| Glass beads | 105015 | ||
| Chloroform | Boom | 92013505.1000. | |
| IAA | 106630 | ||
| Nanodrop | Nanodrop | ND-100 | |
| Agilent BioAnalyser | Agilent | G2940CA | |
| Superscript III | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| AA-dUTP | Life technologies Invitrogen | AM8439 | |
| DDT | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| First Strand buffer | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| NaOH | SigmaAldrich | S8045-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H4034-500G | |
| DyLight-550 | Thermoscientiffic | 62262 | |
| DyLight-650 | Thermoscientiffic | 62265 | |
| SHY Buffer | SigmaAldrich | H7033-125ML | |
| Speedvac cooler | Eppendorf | RUGNE3140 | Speedvac concentrator plus |
| Hybridization oven | Grant Boekel | Iso-20 | |
| Lifter-slips | Erie Scientific | 25x60I-M-5439 | |
| Wipe | KIMTECH | ||
| SDS | SigmaAldrich | L3771-100g | |
| SSC | SigmaAldrich | W302600-1KG-K | |
| Genpix autoloader 4200A1 | MSD analytical technologies | Microarray scanner | |
| Sodium bicarbonate | SigmaAldrich | 104766 |
Riferimenti
- Kayala, M. A., Baldi, P. Cyber-T web server: differential analysis of high-throughput data. Nucleic Acids Res. 40, W553-W559 (2012).
- Chang, T. W. Binding of cells to matrixes of distinct antibodies coated on solid surface. J. Immunol. Methods. 65, 217-223 (1983).
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science. 270, 467-470 (1995).
- Galau Levi, A., A, G., Wetzstein, H. Y. A rapid procedure for the isolation of RNA from high-phenolic-containing tissues of pecan. 27 (12), 1316-1318 (1992).
- Lopez-Gomez, R., Gomez-Lim, M. A. A method for extraction of intact RNA from fruits rich in polysaccharides using ripe mango mesocarp. (5), 440-442 (1992).
- Salzman, R. A., Fujita, T., Salzman, Z., Hasegawa, P. M., Bressan, R. A improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates. Plant Molecular Biology Report. 17, 11-17 (1999).
- Kiefer, E., Heller, W., Ernst, D. A simple and efficient protocol for isolation of functional RNA from plant tissues rich in secondary metabolites. Plant Mol. Biol. Report. 18, 33-39 (2000).
- Tattersall, E. A. R., Ergul, A., Alkayal, F., Deluc, L., Cushman, J. C., Cramer, G. R. Comparison of methods for isolating high-quality RNA from leaves of grapevine. Am. J. Enol. Vitic. 56, 400-406 (2005).
- Van Hijum, S. A. F. T., Garcia de la Nava, J., Trelles, O., Kok, J., Kuipers, O. P. MicroPreP: a cDNA microarray data pre-processing framework. Appl.Bioinformatics. 2, 241-244 (2003).
- Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat.Rev.Microbiol. 6, 288-301 (2008).
- Afzal, M., Shafeeq, S., Kuipers, O. P. LacR is a repressor of lacABCD and LacT is an activator of lacTFEG, constituting the lac gene cluster in Streptococcus pneumoniae. Appl. Environ. Microbiol. 80, 5349-5358 (2014).
- Afzal, M., Shafeeq, S., Henriques-Normark, B., Kuipers, O. P. UlaR activates the expression of the ula operon in Streptococcus pneumoniae in the presence of ascorbic acid. Microbiol. Read. Engl. , (2014).
- Hendriksen, W. T., et al. Site-specific contributions of glutamine-dependent regulator GlnR and GlnR-regulated genes to virulence of Streptococcus pneumoniae. Infect. Immun. 76, 1230-1238 (2008).
- Kloosterman, T. G., Kuipers, O. P. Regulation of arginine acquisition and virulence gene expression in the human pathogen Streptococcus pneumoniae by transcription regulators ArgR1 and AhrC. J. Biol. Chem. 286, 44594-44605 (2011).
- Kloosterman, T. G., Bijlsma, J. J. E., Kok, J., Kuipers, O. P. To have neighbour’s fare: extending the molecular toolbox for Streptococcus pneumoniae. Microbiol. Read. Engl. 152, 351-359 (2006).
- Blom, E. J., et al. FIVA: Functional Information Viewer and Analyzer extracting biological knowledge from transcriptome data of prokaryotes. Bioinforma. Oxf. Engl. 23, 1161-1163 (2007).
- Blom, E. J., et al. Prosecutor: parameter-free inference of gene function for prokaryotes using DNA microarray data, genomic context and multiple gene annotation sources. BMC Genomics. 9, 495 (2008).
- Blom, E. J., et al. DISCLOSE : DISsection of CLusters Obtained by SEries of transcriptome data using functional annotations and putative transcription factor binding sites. BMC Bioinformatics. 9, 535 (2008).
- Baerends, R. J. S., et al. Genome2D: a visualization tool for the rapid analysis of bacterial transcriptome data. Genome Biol. 5 (5), R37 (2004).
- De Jong, A., Pietersma, H., Cordes, M., Kuipers, O. P., Kok, J. PePPER, a webserver for prediction of prokaryote promoter elements and regulons. BMC Genomics. 13, 229 (2012).
- Lanie, J. A., et al. Genome sequence of Avery’s virulent serotype 2 strain D39 of Streptococcus pneumoniae and comparison with that of unencapsulated laboratory strain R6. J. Bacteriol. 189, 38-51 (2007).
- Molecular Devices, Corp. . GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners-Use’s Guide and Tutorial. , (2005).
