Een snelle en betrouwbare Pipeline voor Bacteriële Transcriptome Analyse Case study: Serine-afhankelijke genregulatie in<em> Streptococcus pneumoniae</em
Summary
This manuscript describes the use of state-of-the-art technology provided by DNA-microarrays. Microarrays provide an overview of the transcriptomic changes in bacteria incurred under a specific condition. Moreover, we highlight the ease by which large amounts of data can be analyzed by using convenient in-house developed software packages.
Abstract
Genexpressie en de regulering zijn zeer belangrijk voor het gedrag van cellen onder verschillende omstandigheden is. Verschillende technieken worden tegenwoordig gebruikt om genexpressie te bestuderen, maar de meeste zijn beperkt in termen van het verschaffen van een overzicht van de expressie van de gehele transcriptoom. DNA microarrays bieden een snelle en economisch onderzoek technologie, die een volledig overzicht van de wereldwijde genexpressie geeft en hebben een groot aantal toepassingen, waaronder de identificatie van nieuwe genen en transcriptiefactorbindingsplaatsen, karakterisering van transcriptionele activiteit van de cellen en ook helpen bij het analyseren van duizenden genen (in een experiment). In de huidige studie, hebben de voorwaarden voor bacteriële transcriptoomanalyse van cel oogst aan DNA microarray-analyse geoptimaliseerd. Rekening houdend met de tijd, kosten en nauwkeurigheid van de proeven, dit technologieplatform blijkt zeer nuttig en universeel applicabale voor het bestuderen bacteriële transcripto zijnmes. Hier hebben we DNA microarray-analyse met Streptococcus pneumoniae als case-studie uit te voeren door het vergelijken van de transcriptionele respons van S. pneumoniae gekweekt in aanwezigheid van verschillende concentraties L-serine in het medium. Totaal RNA werd geïsoleerd met behulp van een Malcaloïde methode waarbij een RNA isolatie kit en kwaliteit van RNA werd gecontroleerd met behulp van een RNA kwaliteitscontrole kit. cDNA werd bereid met behulp van reverse transcriptase en het cDNA monsters werden gelabeld via een twee amine-reactieve fluorescerende kleurstoffen. Zelfgemaakte DNA microarray glaasjes werden gebruikt voor hybridisatie van de gelabelde cDNA monsters en microarray data werden geanalyseerd met behulp van een cDNA microarray data voorverwerking raamwerk (Microprep). Tenslotte Cyber-T werd gebruikt om de gegenereerde met Microprep ter identificatie van statistisch significant differentieel tot expressie gebrachte genen te analyseren. Bovendien, in-house gebouwd softwarepakketten (peper, FIVA, openbaren, MINISTERIE, Genome2D) werden gebruikt om te analyserengegevens.
Introduction
De studie van de hele set van mRNA overvloed (transcriptome) gecodeerd door het genoom van een eencellig organisme of een eukaryote cel op een bepaald tijdstip of in een bepaalde staat, inclusief genoverexpressie of knock-out, heet transcriptomics. Transcriptomics kunnen we waarnemen in hoeverre genen tot expressie gebracht onder een bepaalde voorwaarde op het tijdstip X en geeft ons informatie over hoe sterk de genen opzichte van een referentie worden uitgedrukt.
Een microarray is een tweedimensionale array op een vast substraat (meestal een glasplaatje of silicium dunne-film cel) die kunnen worden gebruikt om grote hoeveelheden biologisch materiaal analyse met behulp van high-throughput screening, en geminiaturiseerde multiplex en parallelle verwerking en detectie methoden. Microarrays zijn er in verschillende soorten, met inbegrip van DNA-microarrays, eiwit-microarrays, peptide microarrays, tissue microarrays, antilichaam microarrays, cellulaire microarrays en anderen. Een DNA microarrayin feite een samenstel van microscopische DNA spots bevestigd aan een vast oppervlak, gewoonlijk glas. DNA microarrays worden gebruikt om de expressieniveaus van een gen of een reeks van genen simultaan meten of meerdere gebieden genotype van een genoom 2,3. Picomolen (10 -12 mol) van een probe aanwezig in elke DNA plek die een specifieke DNA sequentie, ook bekend als een reporter voorstelt. De gemerkte mRNA-moleculen van de monsters worden 'targets. Fluoroforen worden gebruikt voor probe-target hybridisatie en detectie van fluorofoor-gelabelde doelwitten meet het relatieve abundantie van nucleïnezuursequenties in het doel. Een microarray experiment kan meerdere genetische tests parallel bereiken omdat een reeks tienduizenden probes bevatten. De indeling van een simpele microarray experiment wordt getoond in figuur 1. Recent werd opgericht in onze en andere laboratoria die deze arrays zijn herbruikbaar, die deze techniek zeer kosteneffectief maakt effective.
Verschillende RNA-isolatie en zuivering technieken zijn ontwikkeld door de jaren heen, waaronder C-TAB, SDS en GT methoden 4-8. Verder verschillende commerciële kits beschikbaar. Genexpressie hoge kwaliteit RNA is zeer belangrijk. Daarom worden het RNA isolatiemethoden gemodificeerd om een maximumhoeveelheid van RNA krijgen. Ook de stappen voor cDNA bereiding en het kenmerken van cDNA geminimaliseerd. Normalisering van de gegevens nadat het scannen is ook efficiënt uitgevoerd door het gebruik van in-huis gebouwd softwarepakketten en gereedschappen 9.
Streptococcus pneumoniae is een Gram-positieve menselijke pathogeen die de nasofarynx koloniseert en is de oorzaak van meervoudige infecties zoals pneumonie, sepsis, otitis media en meningitis 10. De bacterie kan een grote verscheidenheid van de voor groei en overleving 11,12 voedingsstoffen gebruiken. Een aantal studies zijn uitgevoerd op de uitgevoerdepneumokokken stikstof metabolisme en regelgeving benadrukken van het belang van aminozuren en hun rol in virulentie 13,14. In deze studie, de transcriptomische reactie van S. pneumoniae veranderende concentraties van L-serine, een aminozuur overvloedig aanwezig is in het menselijk bloedplasma wordt gemeld met behulp van DNA microarrays. De transcriptomische reactie van S. pneumoniae gekweekt in een minimale concentratie van L-serine (150 uM) werd vergeleken met die gekweekt in een maximale concentratie (10 mM) van serine. Chemisch gedefinieerd medium (CDM of minimaal medium) 15 werd gebruikt voor dit onderzoek om de concentratie van serine regelen. De focus van deze studie is om deze techniek gebruiksvriendelijk te maken en verschillende gereedschappen voor data normalisatie en analyses. Daarom is een aantal instrumenten ontwikkeld voor analyse en interpretatie van de gegevens. FIVA (functionele informatie Viewer en Analyzer) biedt een platform voor het verwerken van de informatie in clusters van genen metgelijkaardige genexpressie patronen en voor de aanleg van functionele profielen 16. MINISTERIE is een ander softwarepakket dat de identificatie van mogelijke functies en annotaties van genen 17 vergemakkelijkt. Door gebruik van clustering methoden, beschrijven levert een DNA bindingsplaats algoritme. Cis van regelgevende motieven van genen kan worden geprojecteerd door dit algoritme 18. Genome2D biedt een Windows gebaseerd platform voor visualisatie en analyse van transcriptoom gegevens door het aanbieden van verschillende kleur varieert met de veranderingen in genexpressie niveaus karakteriseren op een genoomkaart 19. De peper webserver biedt, in aanvulling op de alles-in-één analysemethode, een toolbox voor de mijnbouw voor regulonen, promotors en transcriptiefactorbindingsplaatsen 20. Volledige annotatie van intergene gebieden in een bacterieel genoom kan worden bereikt door dit pakket. Biologen kunnen veel baat hebben bij Pepper als het biedt hen een platform voor het ontwerpen van experiments zodat de veronderstelde informatie kan worden bevestigd in vitro 20. Deze softwarepakketten belangrijke bijdrage leveren aan de microarray-analyse als de meeste van hen zijn vrij verkrijgbaar en maken de gegevens normalisering en analyse zeer betrouwbaar.
Protocol
Representative Results
Discussion
We beschrijven een gebruiksvriendelijke protocol dat kan worden toegepast om hele transcriptoom bacteriën voeren. Het belangrijkste punt van deze bijzondere techniek is dat de voorwaarde waaronder de cellen geoogst variëren. Na het oogsten van de cellen en RNA-isolatie, deze techniek wordt gelijk voor alle soorten van bacteriële monsters en volgt exact identiek stappen en derhalve kan worden toegepast op elk type bacteriekweek. Het protocol is erg eenvoudig en handig en begint vanaf RNA isolatie. De RNA-isolatie prot…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Anne de Jong en Siger Holsappel voor hulp bij het DNA microarrays dia productie. Ondersteuning Anne de Jong's voor bio-analyse wordt ook gewaardeerd. We danken ook Jelle Slager voor de herziening van het papier. Mohammed Afzal en Irfan Manzoor worden ondersteund door de GC University, Faisalabad, Pakistan onder de faculteit ontwikkelingsprogramma van HEC Pakistan.
Materials
| Acid phenol | SigmaAldrich | P4682 | |
| Roche RNA isolation kit | Roche Applied Science | 11828665001 | |
| Glass beads | 105015 | ||
| Chloroform | Boom | 92013505.1000. | |
| IAA | 106630 | ||
| Nanodrop | Nanodrop | ND-100 | |
| Agilent BioAnalyser | Agilent | G2940CA | |
| Superscript III | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| AA-dUTP | Life technologies Invitrogen | AM8439 | |
| DDT | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| First Strand buffer | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| NaOH | SigmaAldrich | S8045-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H4034-500G | |
| DyLight-550 | Thermoscientiffic | 62262 | |
| DyLight-650 | Thermoscientiffic | 62265 | |
| SHY Buffer | SigmaAldrich | H7033-125ML | |
| Speedvac cooler | Eppendorf | RUGNE3140 | Speedvac concentrator plus |
| Hybridization oven | Grant Boekel | Iso-20 | |
| Lifter-slips | Erie Scientific | 25x60I-M-5439 | |
| Wipe | KIMTECH | ||
| SDS | SigmaAldrich | L3771-100g | |
| SSC | SigmaAldrich | W302600-1KG-K | |
| Genpix autoloader 4200A1 | MSD analytical technologies | Microarray scanner | |
| Sodium bicarbonate | SigmaAldrich | 104766 |
Riferimenti
- Kayala, M. A., Baldi, P. Cyber-T web server: differential analysis of high-throughput data. Nucleic Acids Res. 40, W553-W559 (2012).
- Chang, T. W. Binding of cells to matrixes of distinct antibodies coated on solid surface. J. Immunol. Methods. 65, 217-223 (1983).
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science. 270, 467-470 (1995).
- Galau Levi, A., A, G., Wetzstein, H. Y. A rapid procedure for the isolation of RNA from high-phenolic-containing tissues of pecan. 27 (12), 1316-1318 (1992).
- Lopez-Gomez, R., Gomez-Lim, M. A. A method for extraction of intact RNA from fruits rich in polysaccharides using ripe mango mesocarp. (5), 440-442 (1992).
- Salzman, R. A., Fujita, T., Salzman, Z., Hasegawa, P. M., Bressan, R. A improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates. Plant Molecular Biology Report. 17, 11-17 (1999).
- Kiefer, E., Heller, W., Ernst, D. A simple and efficient protocol for isolation of functional RNA from plant tissues rich in secondary metabolites. Plant Mol. Biol. Report. 18, 33-39 (2000).
- Tattersall, E. A. R., Ergul, A., Alkayal, F., Deluc, L., Cushman, J. C., Cramer, G. R. Comparison of methods for isolating high-quality RNA from leaves of grapevine. Am. J. Enol. Vitic. 56, 400-406 (2005).
- Van Hijum, S. A. F. T., Garcia de la Nava, J., Trelles, O., Kok, J., Kuipers, O. P. MicroPreP: a cDNA microarray data pre-processing framework. Appl.Bioinformatics. 2, 241-244 (2003).
- Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat.Rev.Microbiol. 6, 288-301 (2008).
- Afzal, M., Shafeeq, S., Kuipers, O. P. LacR is a repressor of lacABCD and LacT is an activator of lacTFEG, constituting the lac gene cluster in Streptococcus pneumoniae. Appl. Environ. Microbiol. 80, 5349-5358 (2014).
- Afzal, M., Shafeeq, S., Henriques-Normark, B., Kuipers, O. P. UlaR activates the expression of the ula operon in Streptococcus pneumoniae in the presence of ascorbic acid. Microbiol. Read. Engl. , (2014).
- Hendriksen, W. T., et al. Site-specific contributions of glutamine-dependent regulator GlnR and GlnR-regulated genes to virulence of Streptococcus pneumoniae. Infect. Immun. 76, 1230-1238 (2008).
- Kloosterman, T. G., Kuipers, O. P. Regulation of arginine acquisition and virulence gene expression in the human pathogen Streptococcus pneumoniae by transcription regulators ArgR1 and AhrC. J. Biol. Chem. 286, 44594-44605 (2011).
- Kloosterman, T. G., Bijlsma, J. J. E., Kok, J., Kuipers, O. P. To have neighbour’s fare: extending the molecular toolbox for Streptococcus pneumoniae. Microbiol. Read. Engl. 152, 351-359 (2006).
- Blom, E. J., et al. FIVA: Functional Information Viewer and Analyzer extracting biological knowledge from transcriptome data of prokaryotes. Bioinforma. Oxf. Engl. 23, 1161-1163 (2007).
- Blom, E. J., et al. Prosecutor: parameter-free inference of gene function for prokaryotes using DNA microarray data, genomic context and multiple gene annotation sources. BMC Genomics. 9, 495 (2008).
- Blom, E. J., et al. DISCLOSE : DISsection of CLusters Obtained by SEries of transcriptome data using functional annotations and putative transcription factor binding sites. BMC Bioinformatics. 9, 535 (2008).
- Baerends, R. J. S., et al. Genome2D: a visualization tool for the rapid analysis of bacterial transcriptome data. Genome Biol. 5 (5), R37 (2004).
- De Jong, A., Pietersma, H., Cordes, M., Kuipers, O. P., Kok, J. PePPER, a webserver for prediction of prokaryote promoter elements and regulons. BMC Genomics. 13, 229 (2012).
- Lanie, J. A., et al. Genome sequence of Avery’s virulent serotype 2 strain D39 of Streptococcus pneumoniae and comparison with that of unencapsulated laboratory strain R6. J. Bacteriol. 189, 38-51 (2007).
- Molecular Devices, Corp. . GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners-Use’s Guide and Tutorial. , (2005).
