A Pipeline rápido e confiável para estudo de Análise de Caso bacteriana transcriptoma: Regulamento Gene Serina-dependente em<em> Streptococcus pneumoniae</em
Summary
This manuscript describes the use of state-of-the-art technology provided by DNA-microarrays. Microarrays provide an overview of the transcriptomic changes in bacteria incurred under a specific condition. Moreover, we highlight the ease by which large amounts of data can be analyzed by using convenient in-house developed software packages.
Abstract
A expressão gênica e de sua regulamentação são muito importantes para entender o comportamento das células sob condições diferentes. Várias técnicas são usadas hoje em dia para estudar a expressão do gene, mas a maioria são limitados em termos de proporcionar uma visão global da expressão de todo o transcriptoma. Microarranjos de DNA oferecem uma tecnologia de pesquisa rápida e econômica, o que dá uma visão completa da expressão gênica global e têm um vasto número de aplicações, incluindo a identificação de novos genes e fator de transcrição locais, caracterização da atividade transcricional das células e também de ligação ajudar na análise de milhares de genes (numa única experiência). No presente estudo, as condições para a análise do transcriptoma bacteriana desde a colheita de células para análise de DNA microarray foram otimizados. Levando-se em conta o tempo, custos e precisão dos experimentos, esta plataforma de tecnologia revela-se muito útil e universalmente applicabale para estudar transcripto bacterianames. Aqui, vamos realizar a análise de DNA microarray com Streptococcus pneumoniae como um caso de estudo comparando as respostas de transcrição de S. pneumoniae foram cultivados na presença de concentrações variáveis de L-serina no meio. O ARN total foi isolado utilizando um método Macaloid usando um kit de isolamento de ARN e a qualidade do ARN foi verificada usando um kit de controlo de qualidade de ARN. O ADNc foi preparado utilizando transcriptase reversa e as amostras de ADNc foram marcados utilizando um dos dois corantes fluorescentes reactivos a aminas. Caseiros lâminas de microarranjos de DNA foram utilizados para a hibridização das amostras de cDNA marcadas e dados de microarranjos foram analisados usando um quadro de pré-processamento de dados de cDNA microarray (Microprep). Finalmente, Cyber-T foi utilizado para analisar os dados gerados usando Microprep para a identificação de genes expressos diferencialmente estatisticamente significativas. Pacotes de software Além disso, em casa construídas (pimenta, FIVA, divulgar, PROCURADOR, Genome2D) foram utilizados para analisardados.
Introduction
O estudo de todo o conjunto de mRNA abundância (transcriptoma) codificadas pelo genoma de um organismo unicelular ou uma célula eucariótica em um momento específico ou sob uma condição específica, incluindo a superexpressão de genes ou knock-out, é chamado transcriptomics. Transcriptomics nos permite observar em que medida os genes são expressos sob uma condição particular em um ponto X tempo e nos dá informações sobre como fortemente os genes são expressas em relação a uma referência.
Uma micromatriz é uma matriz bidimensional em um substrato sólido (geralmente numa lâmina de vidro ou de silício de película fina de células) que podem ser utilizados para ensaiar grandes quantidades de material biológico utilizando rastreio de alto rendimento, e miniaturizado, de processamento e paralelo multiplexado e detecção métodos. Microarrays vêm em vários tipos, inclusive de DNA microarrays, microarrays de proteína, microarrays peptídicos, microarrays de tecidos, microarrays de anticorpos, microarrays celulares e outros. A DNA microarray ébasicamente, um conjunto de manchas de DNA microscópicos fixo a uma superfície sólida, geralmente de vidro. Microarranjos de DNA são usadas para medir os níveis de expressão de um gene ou um conjunto de genes simultaneamente ao genótipo ou várias regiões de um genoma de 2,3. Picomoles (10 -12 moles) de uma sonda estão presentes no interior de cada ponto de ADN que representa uma sequência de ADN específica, também conhecido como um repórter. As moléculas de mRNA rotulados das amostras são chamados «objectivos». Os fluoróforos são usados para medir a hibridação sonda-alvo e detecção de alvos marcados com fluoróforo determina a abundância relativa de sequências de ácido nucleico no alvo. Um experimento de microarray pode realizar vários testes genéticos em paralelo, porque uma matriz pode conter dezenas de milhares de sondas. O layout de um experimento de microarray simples é mostrado na Figura 1. Recentemente, foi criada em nossas e de outros laboratórios que essas matrizes são reutilizáveis, o que torna esta técnica muito boa relação custo-effective.
Diferentes técnicas de isolamento e purificação de RNA foram desenvolvidos ao longo dos anos, incluindo C-TAB, SDS e métodos GT 4-8. Além disso, vários kits comerciais também estão disponíveis. Para a expressão do gene de ARN de alta qualidade é muito importante. Portanto, os métodos de isolamento de ARN são modificados para obter uma quantidade máxima de ARN. Da mesma forma, os passos para a preparação de ADNc e rotulagem de cDNA são minimizados. Normalização de dados após rastreamento também é feito de forma eficiente, utilizando-casa construída em pacotes de software e ferramentas 9.
O Streptococcus pneumoniae é um agente patogénico humano Gram-positiva que coloniza a nasofaringe e é a causa de infecções múltiplas, tais como pneumonia, sepsis e meningite otite média 10. A bactéria pode utilizar uma ampla variedade de nutrientes necessários para o crescimento e sobrevivência 11,12. Um número de estudos foram realizados sobre ometabolismo do nitrogênio pneumocócica e regulação enfatizando a importância de aminoácidos e seu papel na virulência 13,14. Neste estudo, a resposta do transcriptoma de S. pneumoniae para alterar as concentrações de L-serina, um aminoácido presente em abundância no plasma sanguíneo humano, é descrito, utilizando microarrays de ADN. A resposta do transcriptoma de S. pneumoniae crescida em uma concentração mínima de L-serina (150 uM) foi comparada com a cultivada em uma concentração máxima (10 mM) de serina. Meio quimicamente definido (CDM ou meio mínimo) 15 foi utilizado para este estudo para controlar a concentração de serina. O foco deste estudo é fazer com que esta técnica user-friendly e de fornecer ferramentas diferentes para a normalização e análise de dados. Assim, foram desenvolvidas uma série de ferramentas para análise e interpretação dos dados. FIVA (Functional Information Viewer e Analyzer) fornece uma plataforma para processamento de informações contidas nos conjuntos de genes que têmpadrões de expressão gênica semelhantes e para a construção de perfis funcionais 16. PROCURADOR é um outro pacote de software que facilita a identificação de funções putativas e anotações de genes 17. Ao fazer uso de métodos de agrupamento, DIVULGAR fornece um algoritmo de detecção de local de ligação DNA. Cis -regulatory motivos de genes pode ser projetada usando este algoritmo 18. Genome2D oferece uma plataforma baseada em Windows para visualização e análise de dados de transcriptoma, oferecendo diferentes gamas de cores para caracterizar as alterações nos níveis de expressão de genes em um mapa do genoma 19. O webserver Pepper oferece, além do método de tudo-em-uma análise, uma caixa de ferramentas para mineração para regulons, promotores e ligação do factor de transcrição locais 20. Anotação completa das regiões intergénicas num genoma bacteriano pode ser conseguida utilizando este pacote. Os biólogos podem se beneficiar muito de pimenta, pois oferece-lhes uma plataforma para a concepção de experiências de modo que a informação hipotética pode ser confirmada in vitro 20. Estes pacotes de software de contribuir de forma significativa para a análise de microarray como a maior parte deles estão livremente disponíveis e fazer a normalização de dados e análise muito fiável.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós descrevemos um protocolo de fácil utilização que pode ser aplicado para realizar a análise de toda transcriptoma de bactérias. O ponto-chave sobre esta técnica particular é que a condição sob a qual as células são colhidas irão variar. Após a colheita de células e o isolamento de ARN, esta técnica torna-se igual para todos os tipos de amostras bacterianas e segue passos exactamente idênticas e, por conseguinte, pode ser aplicado a qualquer tipo de cultura bacteriana. O protocolo é muito simples e c…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Anne de Jong e Siger Holsappel para obter ajuda com o DNA microarrays produção slide. O apoio da Anne de Jong para análise bioinformática também é apreciado. Agradecemos também a Jelle Slager para a revisão do papel. Muhammad Afzal e Irfan Manzoor são suportados pela Universidade GC, Faisalabad, Paquistão sob o programa de desenvolvimento do corpo docente da HEC Paquistão.
Materials
| Acid phenol | SigmaAldrich | P4682 | |
| Roche RNA isolation kit | Roche Applied Science | 11828665001 | |
| Glass beads | 105015 | ||
| Chloroform | Boom | 92013505.1000. | |
| IAA | 106630 | ||
| Nanodrop | Nanodrop | ND-100 | |
| Agilent BioAnalyser | Agilent | G2940CA | |
| Superscript III | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| AA-dUTP | Life technologies Invitrogen | AM8439 | |
| DDT | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| First Strand buffer | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| NaOH | SigmaAldrich | S8045-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H4034-500G | |
| DyLight-550 | Thermoscientiffic | 62262 | |
| DyLight-650 | Thermoscientiffic | 62265 | |
| SHY Buffer | SigmaAldrich | H7033-125ML | |
| Speedvac cooler | Eppendorf | RUGNE3140 | Speedvac concentrator plus |
| Hybridization oven | Grant Boekel | Iso-20 | |
| Lifter-slips | Erie Scientific | 25x60I-M-5439 | |
| Wipe | KIMTECH | ||
| SDS | SigmaAldrich | L3771-100g | |
| SSC | SigmaAldrich | W302600-1KG-K | |
| Genpix autoloader 4200A1 | MSD analytical technologies | Microarray scanner | |
| Sodium bicarbonate | SigmaAldrich | 104766 |
Riferimenti
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