הערכה של תת-יקוציט חדירת גידול בדגם גידול תת עורי
Summary
This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses.
Abstract
תאים חיסוניים מיוחדים הלחדור מייקרו-הסביבה של הגידול להסדיר את הצמיחה והישרדות של neoplasia. תאים ממאירים חייבים להתחמק או לחתור תחת תגובות חיסוני אנטי-סרטנית על מנת לשרוד ולשגשג. גידולים לנצל מספר המנגנונים השונים של חיסון "בריחה", ובכלל זה הגיוס של DC tolerogenic, תאי T רגולטורים לדיכוי המערכת החיסונית (Tregs), ותאי שמקורם מיאלואידית המדכאים (MDSC) המעכבים תגובות אנטי-סרטניים רעילות לתאים. לעומת זאת, תאים חיסוניים מפעיל אנטי-סרטני יכולים להאט את הצמיחה והתרחבות של גידולים ממאירים: תאים דנדריטים immunostimulatory, תאי רוצח טבעיים שנמל חסינות אנטי גידול מולדת, ותאי T ציטוטוקסי כל יכולים להשתתף בדיכוי גידולים. האיזון בין כדוריות דם לבנות בעד ונגד גידול סופו של דבר קובע את התנהגותו וגורלו של תאים הפכו; מספר רב של מחקרים קליניים בבני אדם נשא את זה. לפיכך, ניתוח מפורט של תת ויקוציטים במייקרו-הסביבה של הגידול הפכה להיות חשובה יותר ויותר. כאן אנו מתארים שיטה לניתוח תת ויקוציטים להסתנן לתוכם נוכחי במייקרו-הסביבה של הגידול במודל גידול עכבר. תאי גידול מלנומה B16 העכבר היו מחוסן תת עורי בעכברי C57BL / 6. בזמן מסוים, גידולים ועור שמסביב היו כריתה כמקשה אחת ומעובדים להשעיות תא בודדות, אשר לאחר מכן היו מוכתמת עבור צבע רב cytometry זרימה. תוך שימוש במגוון של סמני משנה לויקוציטים, היינו יכול להשוות את האחוזים היחסי של חדירה תת ויקוציטים בין שליטה וגידולים להביע chemerin. חוקרים ישתמשו בכלי כזה כדי ללמוד את נוכחות החיסון במייקרו-הסביבה של הגידול ובשילוב עם מדידות גודל קליפר מסורתיות של צמיחת גידול, יהיה פוטנציאל לאפשר להם לברר את ההשפעה של שינויים בהרכב חיסון על צמיחת גידול. כגון טכניקה יכולה להיות מיושמת על כל מודל גידול שבו הגידול וג מייקרו-הסביבה שלהלהיות כריתה ועיבוד.
Introduction
האיזון בין צמיחת גידול וקידום ונסיגה הוא, בחלקו, תלוי באיזון של לויקוציטים הנוכחי במייקרו-הסביבה 1,2 פרו ואנטי-סרטני שחדר. כדי ללמוד מייקרו-הסביבה של הגידול (TME) ובמיוחד לזהות את תת-אוכלוסיות לויקוציטים להסתנן לתוכם, פיתחנו שיטה להערכה של גידולים תת עורית במודל עכברי גידול. החשיבות של לימוד מייקרו-הסביבה של הגידול ידועה ונתמך בספרות. מחקרים רבים הראו כי המאזן של תאי מערכת חיסון פרו ואנטי-סרטניים שחדר יכול להשפיע על התוצאות של גידול, לא רק בעכבר, אלא גם מחקרים בבני אדם (שנסקרו ב3,4). לדוגמא, קוריאל et al. הראה שהחמיר תוצאות קליניות בחולי סרטן השחלות היו מתואמות עם הנוכחות של הגדלת האחוזים של תאים שחדר-גידול רגולציה CD4 + T (Tregs) 5. העבודה שלנו הראתה גם ההשפעה לאchemoattractant ויקוציטים vel על היחס של תת ויקוציטים במודל מלנומה עכבר 6, שגם בקורלציה עם הירידה בצמיחת גידול. לפיכך, הניתוחים מפורטים של תת ויקוציטים בתוך גידול עכשיו הכירו באופן רחב יותר וחשובים יותר ויותר.
ישנן דרכים רבות להעריך את מייקרו-הסביבה של הגידול לחדירה לויקוציטים; למשל קבוצות מהונדסות עכברים הטרנסגניים לבטא חלבוני ניאון שונים על מנת תמונה 7 TME, אימונוהיסטוכימיה וimmunofluorescence סעיפים השתמרו 8, כוללים שיטות הדמיה שונות, כגון MRI, PET, מיקרוסקופיה confocal 9-11 הקלסית – חלקם עם היכולת לפקח intravitally 10,12. אלה יכולים לשמש עם סוכנים שונים מולקולריים הדמיה, כגון חלקיקים 13 או סוכנים בניגוד רומן 14 שתווית תאים חיסוניים. השיטה שלנו היא גישה מבוססת cytometry זרימה ויש לו כמה יתרונות.ראשית, כל מייקרו-הסביבה של הגידול ניתן לדגום; בעת הניתוח, הגידול תת עורי כל והפריפריה שמסביב שעברו כריתה כירורגית לעיבוד. זו מבטלת כל הטיה פוטנציאלית דגימה בתוך גידול יחיד ונותנת ניתוח יותר "גלובלי" של הגידול בכללותו. שנית, באמצעות זרימת ססגוניות cytometry לנתח את תת ויקוציטים מאפשר לנו לאמוד את הפנוטיפ של לויקוציטים מסתנן באופן יותר ספציפי. בהתאם למספר של צבעים המשמשים, ניתן לזהות תת מאוד ספציפיים. זה חשוב כמו שיש כמה תת ויקוציטים בסוג תא מסוים – או אפילו בסיווג תת סוג כללי – שיש פונקציות שונות, כי הם עלולים להיות משמעותיים בקביעת גורלו של הגידול. לדוגמא, תאים דנדריטים plasmacytoid (PDC) היו מעורבים בחסינות אנטי גידול 15. עם זאת, קבוצת משנה CCR9 + של pDCs הוכח להיות 16 tolerogenic, והסטת baרומח של משנה כאמור יכול להיות השפעה על צמיחת גידול.
השיטה שלנו היא מתאימה לתת עורית או גידולים אחרים שניתן שעברו כריתה כמקשה אחת. בידיים שלנו, שעברו כריתת גידולים אחידות בזמן של המתת חסד. עם זאת, מתקבלים על הדעת, כפי שנעשה בחלק מהמחקרים, כי גידול תת עורי יכול להיות שעבר כריתה מלאה עם סגירת העור שמסביב בניתוח הישרדות 17, ובכך מאפשרת הערכה נוספת של בעלי החיים. הניתוח מבוצע לאחר מכן על גידול resected. לפיכך, התוצאות מייצגות נקודת זמן בהתפתחותו של הגידול. אמנם זה מאפשר מבט מפורט למייקרו-הסביבה, היא גם תמונה סטטית של מה הוא ללא ספק תהליך דינמי. עם זאת, לויקוציטים המבודדים (למשל באמצעות מגנטי הפרדה או שיפוע צפיפות) אז יכול להיות מנותח בנפרד מepithelia הגידול וסטרומה, או בשימוש במבחנים אחרים, פונקציונליים להגדיר הפנוטיפ שלהם עוד יותר, כפי שהיה previלכן תיארו 18. שיטה זו, אם כן, תהיה שימושית עבור כל חוקרים מעוניינים להבין את ההרכב של כדוריות הדם לבנות במייקרו-הסביבה של הגידול בנקודת זמן נתונה, אם בהגדרה של מהלך המחלה הטבעי, או לאחר ההפרעות טיפוליות ספציפיות. למרות שלא נעשה על ידי אותנו, וריאציות של הליך זה יכול גם פוטנציאל לשמש כדי לנתח חלקים מסוימים של גידול בבידוד. לדוגמא, בהתחשב בגודלו של הגידול, אזור הפריפריה (ים) יכול להיות גזור מהליבה המרכזית, אולי נימקי של הגידול לתת החוקר יותר מרחבית נפרדת נוכח מייקרו-הסביבה של הגידול.
בתחום המתפתח של אימונולוגיה גידול, שם יהיה ללא ספק מספר גדל באופן אקספוננציאלי של מחקרי הערכת סוכני המערכת החיסונית רומן במודלים עכבריים גידול. מספר דוחות הדגישו את ההבדלים בתפקוד ויקוציטים ספציפיים בתוך הגידול לעומת פריפרית environment. לדוגמא, שפר-יבר et al. הראה במודל של עכברים שמפעיל T אנטיגן ספציפי לתאי CD8 +, בעוד פעיל בפריפריה, הפכו לתאים המדכאים CD8 + T ברגע שהם הוברחו לתוך מייקרו-הסביבה של גידול 19. זה היה בין שאר בשל TGFβ, אבל גורמים אחרים קרוב לוודאי מעורבים גם כן. לפיכך, הערכה תת ויקוציטים – מספרים ויחסים, כמו גם מצב תפקודי – בתוך הגידול עצמו תיתן ייצוג מדויק יותר של ההשפעה של תפקוד מערכת חיסון בפרט על גורל גידול.
הטכניקה שלנו מאפשרת ניתוח מפורט של הגידול ומספקת החוקר הזדמנות לזהות באופן הדוק יותר לשינויים באוכלוסיות לויקוציטים מגישות קודמות.
Protocol
Representative Results
Discussion
ביצוע ניתוח מפורט של מייקרו-הסביבה של הגידול הוא קריטי בקביעת המנגנונים ואת ההשפעות של תפקוד מערכת חיסון. עם הנוכחות הגוברת של immunotherapeutics בתחום הקליני בבני האדם, הבנת ההשפעה של גורמים אלה על leukocytes גידול חדירה הופך הנדרשת בהגדרת מנגנון הפעולה שלהם. בבני אדם, יש לעתים ק?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי R01-CA169354 וR01-047822 מהמכון הלאומי לבריאות ופרס הצטיינות מהמחלקה לענייני יוצאי צבא (ECB). RKP נתמכה על ידי NIH T32 CA009287-30A1, פרס חוקר צעיר ASCO, שד קליפורניה לחקר סרטן פרויקט מלגה, ואגודה אמריקנית לסרטן המודרך מחקר Scholar גרנט; BAZ נתמכה על ידי AI079320 מענק NIH. JM נתמכה על ידי מלגות ממענק אימון T-32 NIH 25 T32-AI07290-, T32-AI07290-24 ואגודה האמריקנית לסרטן מלגת פוסט-דוקטורט PF-12-052-01-CSM.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| RPMI | Cellgro | 10-040 | http://cellgro.com; keep on ice |
| FBS | Cellgro | 35-011-CV | http://cellgro.com |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 14-432-22 | fischersci.com |
| 40 micron filter | Falcon | 08-771-1 | fischersci.com |
| 5 ml syringe | BD | 14-823-35 | fischersci.com |
| surgical scissors/forceps | Roboz | RS-5910 | roboz.com |
| PBS | Cellgro | MT-21-030-CM | http://cellgro.com; keep on ice |
| trypan blue | Cellgro | MT-25-900-CI | fischersci.com |
| hemacytometer | Hausser Scientifice | 02-671-54 | fischersci.com |
| Live/Dead stain | Life Technologies | L34957 | lieftechnologies.com |
| FlowJo software | TreeStar, Inc | flowjo.com |
Riferimenti
- Mantovani, A., et al. Chemokines in the recruitment and shaping of the leukocyte infiltrate of tumors. Semin Cancer Biol. 14 (3), 155-160 (2004).
- Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion. Nat Rev Immunol. 6 (10), 715-727 (2006).
- Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nat Immunol. 14 (10), 1014-1022 (2013).
- Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome. Nat Rev Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
- Curiel, T. J., et al. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nat Med. 10 (9), 942-949 (2004).
- Pachynski, R. K., et al. The chemoattractant chemerin suppresses melanoma by recruiting natural killer cell antitumor defenses. J Exp Med. 209 (8), 1427-1435 (2012).
- Hoffman, R. M. Transgenic nude mice ubiquitously expressing fluorescent proteins for color-coded imaging of the tumor microenvironment. Methods Mol Biol. 1194, 353-365 (2014).
- Mansfield, J. R. Imaging in cancer immunology:phenotyping immune cell subsets in situ in FFPE tissue sections. MLO Med Lab Obs. 46 (6), 12-13 (2014).
- Serres, S., O’Brien, E. R., Sibson, N. R. Imaging angiogenesis, inflammation, and metastasis in the tumor microenvironment with magnetic resonance imaging. Adv Exp Med Biol. 772, 263-283 (2014).
- Schietinger, A., et al. Longitudinal confocal microscopy imaging of solid tumor destruction following adoptive T cell transfer. Oncoimmunology. 2 (11), e26677 (2013).
- Singh, A. S., Radu, C. G., Ribas, A. P. E. T. imaging of the immune system: immune monitoring at the whole body level. Q J Nucl Med Mol Imaging. 54 (3), 281-290 (2010).
- Kilarski, W. W., et al. Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis. PLoS One. 8 (2), e57135 (2013).
- Habibollahi, P., et al. Fluorescent nanoparticle imaging allows noninvasive evaluation of immune cell modulation in esophageal dysplasia. Mol Imaging. 13 (3), 1-11 (2014).
- Balducci, A., et al. A novel probe for the non-invasive detection of tumor-associated inflammation. Oncoimmunology. 2 (2), e23034 (2013).
- Liu, C., et al. Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell cross-priming and tumor regression in mice. J Clin Invest. 118 (3), 1165-1175 (2008).
- Hadeiba, H., et al. CCR9 expression defines tolerogenic plasmacytoid dendritic cells able to suppress acute graft-versus-host disease. Nat Immunol. 9 (11), 1253-1260 (2008).
- McLean, M., et al. A BALB/c murine lung alveolar carcinoma used to establish a surgical spontaneous metastasis model. Clin Exp Metastasis. 21 (4), 363-369 (2004).
- Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. Isolation of immune cells from primary tumors. J Vis Exp. (64), e3952 (2012).
- Shafer-Weaver, K. A., et al. Cutting Edge: Tumor-specific CD8+ T cells infiltrating prostatic tumors are induced to become suppressor cells. J Immunol. 183 (8), 4848-4852 (2009).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
- Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation. Cytometry A. 71 (6), 379-385 (2007).
- Hackstein, H., et al. Heterogeneity of respiratory dendritic cell subsets and lymphocyte populations in inbred mouse strains. Respir Res. 13, 94 (2012).
- Ostrand-Rosenberg, S. Myeloid-derived suppressor cells: more mechanisms for inhibiting antitumor immunity. Cancer Immunol Immunother. 59 (10), 1593-1600 (2010).
- Curran, M. A., Montalvo, W., Yagita, H., Allison, J. P. PD-1 and CTLA-4 combination blockade expands infiltrating T cells and reduces regulatory T and myeloid cells within B16 melanoma tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4275-4280 (2010).
- Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. Cancer immunoediting: integrating immunity’s roles in cancer suppression and promotion. Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).
